Disseny, construcció i caracterització de zimògens de ribonucleases

Abstract

El disseny i la producció de zimògens de ribonucleases que puguin ser específicament activats per la proteasa d’un patogen, constitueix un enginyós mecanisme per controlar la seva activitat enzimàtica i, conseqüentment, la seva citotoxicitat. En aquest treball es descriu la construcció de 12 variants de zimògens d’Onconasa® (ONC) i de ribonucleasa pancreàtica humana (HP-RNasa), activables per la proteasa del Virus de la Immunodeficiència Humana (HIV-1 PR). Els zimògens d’ONC i HP-RNasa s’activen in vitro amb la proteasa, mantenint una elevada estabilitat sobretot els zimògens d’ONC. L’augment d’activitat ribonucleolítica de la forma activada respecte el precursor, que resulta baix per les variants d’ONC, és d’unes 150 vegades per les d’HP-RNasa. Els zimògens d’ONC presenten una molt bona internalització en limfòcits-T humans, a més de no presentar, en cap dels casos, citotoxicitat en cèl·lules Jurkat en cultiu abans de l’activació. Finalment, s’ha estudiat l’estructura i dinàmica de la forma intacta d’un dels zimògens d’ONC per Ressonància Magnètica Nuclear (NMR), permetent el desenvolupament i optimització futura de nous zimògens més efectius com a agents antivirals.

Design and production of ribonuclease zymogens that could be specifically activated by proteases of pathogens, would provide an ingenious mechanism to control their activity and, consequently, their cytotoxicity. Here we report the construction of 12 variants of Onconase® (ONC) and Human Pancreatic Ribonuclease (HP-RNase) zymogens that are recognized and activated specifically by the Human Immunodeficiency Virus Protease (HIV-1 PR). ONC- and HP-RNase- zymogens are activated by the HIV-1 PR in vitro, and mantain a high conformational stability mainly in ONC variants. The increase of catalytic efficiency of the activated form compared to the precursor has been low in ONC zymogens, but 150-fold for those of HP-RNase. ONC zymogens can internalize in human T-lymphocyte Jurkat cells efficiently, and all of them do not show any cytotoxicity in this type of cells before their activation. Finally, the structure and dynamics of intact form of one of ONC zymogens has been determined by Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (NMR). This represents a first step toward the development and optimization of more effective zymogens, as antiviral agents.