Implication of mast cells, nerve growth factor and splanchnic nerves in postoperative ileus. Study in patients undergoing abdominal surgery and in a rat experimental model

Abstract

El íleo postoperatorio (IPO) se define como el cese temporal de la motilidad propulsiva gastrointestinal (GI) en pacientes sometidos a cirugía intestinal. En pacientes y en modelos experimentales de IPO, se ha observado degranulación de mastocitos (MCs) en lavado peritoneal. Estudios con fármacos estabilizadores de MCs o en modelos en roedores carentes de mastocitos apoyan la participación de los MCs en el IPO. No obstante, los mecanismos involucrados aún están por definir. La interacción nervio-mastocito, así como la interacción con el factor de crecimiento nervioso (NGF), podrían representar un factor clave en el desarrollo del IPO. El objetivo del presente trabajo ha sido estudiar el IPO humano caracterizando la activación de los mastocitos peritoneales (PMCs) durante la cirugía colorectal. A parte, también nos propusimos explorar el papel del NGF sobre los MCs y la interacción nervio-mastocito en un modelo experimental de IPO en rata. Primero se estudió el IPO humano. Evaluamos la liberación de proteasas mastocitarias (mediante la técnica de ELISA) en el lavado peritoneal de pacientes sometidos a cirugía colorectal por laparoscopia y laparotomía, así como también la densidad de MCs (por inmunohistoquímica) y la recuperación clínica postoperatoria. Seguidamente se puso a punto un modelo de IPO en rata para profundizar en el papel de los MCs. En él, evaluamos el efecto del antagonista del receptor del NGF, K252a. Previamente habíamos demostrado el efecto in vitro del K252a sobre PMCs. Asimismo, hemos evaluado la participación de los ganglios de la raíz dorsal (DRG) en el IPO además de evaluar las consecuencias funcionales de la activación mastocitaria en animales tratados con el estabilizador de mastocitos ketotifeno o mediante la exposición del intestino al degranulador de mastocitos compuesto 48/80. Los resultados de este trabajo demuestran que la cirugía colorectal induce la liberación de proteasas mastocitarias en la cavidad peritoneal en aquellos pacientes que desarrollaron un IPO. En la rata, inmediatamente tras la inducción del modelo, se produjo un aumento en la liberación de la proteasa mastocitaria RMCP-6 (inmunoensayo) en la cavidad peritoneal. A las 24h, se observó un retraso en el tránsito GI y un aumento en la expresión de la interleuquina-6 (IL-6, RT-qPCR) y en la actividad mieloperoxidasa (MPO) en las muestras de íleon. El K252a inhibió la degranulación in vitro de los PMCs (valorada mediante el ensayo de la β-hexosaminidasa) así como también atenuó la liberación de RMCP-6 y la expresión génica tanto de IL-6, como de RMCP-2 y TrkA (receptor del NGF) en el modelo. Sin embargo, no mejoró la motilidad GI. Por otro lado, la expresión de mediadores calcitonin gene-related peptide (CGRP), NGF, TrkA and protease-activated receptor-2 en los DRGs aumentó tras la inducción del modelo. Estos cambios no se vieron afectados tras el tratamiento con ketotifeno o la exposición a C48/80. En cambio, el C48/80 si produjo un retraso en el vaciamiento gástrico/tránsito intestinal así como también aumentó la expresión de IL-6 y actividad MPO. El uso de ketotifeno, previno el retraso en el vaciamiento gástrico y la disminución post-operatoria del output fecal. Este trabajo nos permite concluir que los MCs participan en el IPO y que la interacción entre el NGF, TrkA y PMCs puede representar una diana para el tratamiento del IPO u otras alteraciones mediadas por mastocitos.

Postoperative ileus (POI) is defined as a temporal cessation of propulsive gastrointestinal (GI) motility in patients undergoing abdominal surgery, especially those subjected to intestinal resection. Mast cell (MC) degranulation has been reported in patients undergoing abdominal surgery and in experimental models of POI. MC stabilizers or the use of MC-deficient mutant models point towards a role for MCs in POI, but the exact mechanisms involved remains unclear. Interactions between MCs and nerve endings or inflammatory mediators such as the nerve growth factor (NGF) may represent a key factor in POI pathogenesis. The aim of this work was to study POI in human patients by characterizing the activation of peritoneal mast cells (PMCs) in colorectal surgery. A part from that, we also aimed to explore the role of NGF antagonists on MCs and MC-nerve interactions in a rat model of POI. We firstly studied human POI. We evaluated MC protease release in peritoneal lavage (by means of ELISA) collected from patients undergoing laparoscopic and open colorectal surgery. In these patients we also studied MC density in colonic samples (by immunohistochemistry) and postoperative clinical recovery. Secondly, we set up a model of POI in rat to further explore the role of MCs. We evaluated the effect of pre-treatment with NGF receptor antagonist, K252a. In vitro effects of K252a were also evaluated on rat PMCs. Activation of dorsal root ganglia (DRG) in POI rat model was also characterized in a separate experiment in which the role of MCs was investigated using ketotifen (MC stabilizer) and compound 48/80 (C48/80, MC degranulator). Our study demonstrated release of MC proteases into peritoneal cavity after colorectal surgery. This protease release was observed only in patients with a subsequent delay of clinical recovery (those who developed POI). In our animal study we demonstrated that induction of POI by intestinal manipulation immediately evokes release of MC protease RMCP-6 in the peritoneal cavity. At 24h after intestinal manipulation, our model also presented delayed GI transit and increased expression of interleukin-6 (IL-6, RT-qPCR) and myeloperoxidase activity (MPO) in ileum samples. In contrast, density of intestinal MCs (immunohistochemistry and toluidine blue staining) and RMCP-2 and 6 gene expressions (RT-qPCR) in the ileum were unaltered in the animal POI model. K252a prevented PMC degranulation in vitro (β-hexosaminidase assay) and the release of RMCP-6 in the POI model. In addition, K252a attenuated IL-6 expression after intestinal manipulation and decreased basal peritoneal release of RMCP-2 and TrkA (NGF receptor) gene expression However, GI transit was not ameliorated after K252a treatment. Intestinal manipulation in the POI model also increased gene expression of calcitonin gene-related peptide, NGF, TrkA and protease-activated receptor-2 in somas of DRGs but these changes were not modulated by ketotifen or C48/80. In contrast, C48/80 did delay GI transit and induced up-regulation of IL-6 and MPO activity. Ketotifen also prevented delayed gastric emptying and the postoperative decrease of fecal output. To sum up, our results indicate that intestinal manipulation is associated with a local response of MCs in the peritoneal cavity. Intestinal manipulation delayed GI motility in vivo, induced intestinal inflammation and activated DRGs. K252a stabilized MCs and down-regulated IL-6 expression in the inflammatory response leading to POI. Our data also showed that MCs are involved in GI motility alteration and inflammation after intestinal manipulation. In contrast, activation of DRGs seems to be independent of MC activation based on our assessment using a pharmacological approach. We conclude that MCs participate in POI and that interactions between NGF, TrkA and PMCs may represent a target for treatment of POI or other MC-mediated diseases.