Design of protein nanoparticles for cell targeting and blood brain barrier crossing

Abstract

En estos últimos años, muchos nuevos materiales han sido involucrados en los campos de las nanotecnologías, y especialmente en nanomedicina. Las nanoparticulas formadas por proteínas son un ejemplo de bio-material que está atrayendo cada vez más la atención debido a sus características tanto biológicas como estructurales, como por ekjemplo su baja toxicidad, baja inmunogenicidad y su biodegradabilidad. Además, a través de la ingeniería genética, estas proteínas se pueden diseñar para que formen multímeros estructuras con la capacidad de auto-ensamblarse en una estructura similar a las capsides virales. Estas propiedades permiten el utilizo de estas nanoparticulas proteicas en el diseño de vectores para la entrega de fármacos o genes terapéuticos, el diseño de vacunas y kits de diagnósticos. La entrega de moléculas terapéuticas supones la superación de barreras tanto extracelulares como intracelulares. Gracias a la exposición de ligandos en la superficie externa y a su tamaño reducido, las nanopartículas pueden superar estas barreras como, por ejemplo, la Barrera Hematoencefalica (BBB). En este contexto, hemos desarrollado unas nanopartículas proteicas auto-ensamblables con especificidad para los receptores LDLR, con el propósito de utilizarlas como vehículos para el tratamiento de enfermedades en el Sistema Nervioso Central (SNC). Cuatro diferentes ligandos específicos para los LDLR se fusionaron a la proteína GFP -His; entre ellos, solamente el ligando ApoB fue capaz de promover la formación de nanopartículas proteicas por interacciones intermoleculares entre el mismo ApoB, la cola de histidinas y los monómeros vecinos. Estas nanoparticula han demostrado una buena internalización en líneas celulares LRDR+, en experimentos in vitro. Sin embargo, cuando se probó en un modelo in vivo, solamente dos proteínas ligandos que no forman nano-particulas se han detectado en puntos de tiempo post-administración cortos. Esto indicaría que la formación de nano-estructuras no favorece la acumulación en el SNC. Paralelamente, se estudiaron nano-partículas proteicas dirigidas hacia el receptor CXCR4, un receptor de superficie celular expuesto en la superficie celular de las células metástaticas de cáncer colorrectal. En este estudio la proteína T22-IRFP-HIS fue elegida para sustituir a la ApoB-GFP-HIS y también se observó la formación de nanoparticulas autoensamblables que además poseen una alta internalización en las células CXCR4+. Esto indica que la proteína andamio no afecta a la formación de nanopartículas, ni afecta a la especificidad del ligando de direccionamiento. La fuerza que guía a la formación de nanopartículas se basa principalmente en las interacciones electrostáticas entre monómeros de proteínas. Además este fenómeno puede ser interrumpido y revertido por la presencia de alta concentración de sal. De hecho, cuando las nanoparticulas de T22-IRFP-HIS se dializan a un tampón con alta concentración de sal, las estructuras se desensamblan en monómeros y además reducen su eficiencia de penetrabilidad celular. Esto demostraría que el tamaño y tal vez la multivalencia de la nanopartículas proteicas frente a la monovalencia de los monómeros es un factor clave para el reconocimiento celular especifico y la internalización de las proteínas.

With the development of nanotechnology and nanomedicine, more and more materials have been involved in these fields, protein based nanoparticles have become another biomaterial that is developing fast and attracts growing attention. They are non-toxic, low-antigenic, biodegradable, metabolizable, and with genetic engineering, it is easy to modify their structure, surface charge, to allow heterologous ligand display, to improve stability and more importantly, proteins can be designed to form multimeric structures with the ability to self-assemble in a similar way as viral capsid proteins do. These properties enable protein particles to be widely used in targeting and delivery of therapeutic drugs, vaccine designing, diagnosis, and gene therapy.Nanoparticle-mediated targeting delivery is also widely used when overcoming barriers in human body, especially in the BBB. Nanoparticles could help drugs to cross the BBB because they have suitable size and could exhibit targeting ligands on the surface. These ligands could interact with receptors at the BBB and then transport nanoparticles across BBB by receptor mediated transcytosis. Based on that, the first part of this context is aim to construct self-assembled protein nanoparticles targeting on LDLR (which is a high affinity binding site in brain capillaries), with the purpose of using nanostructured materials as vehicles for the systemic treatment of CNS diseases. Four different LDLR specific ligands were fused to GFP protein and His tag; among those, only ApoB ligand, was able to promote the formation of protein nanoparticles by intermolecular interactions involving the ApoB ligand and the His tag of a neighboring monomer. This ApoB empowered protein nanoparticle showed higher internalization ability on LDLR+ cells, and higher permeability in BBB in vitro model. However, when tested those proteins displaying LDLR ligands in an in vivo model, two proteins which were not able to form nanoparticle accumulated in at short post-administration time points, indicating that the nanoparticulate form is not favoring the accumulation apart from preventing the transient accumulation. This work brings up new concepts of BBB crossing properties by using functional protein nanoparticles. The second part of this context is aimed to produce size-controllable protein nanoparticles towards CXCR4 receptor (CXCR4, a cell surface receptor marker associated with metastasis-forming colorectal cancer cells and other human pathologies) expressing cells. In this part, a new scaffold protein iRFP was chosen to replace GFP, we determined that it could also self-assemble into nanoparticles, showing high penetration into CXCR4+ cells. This indicates that the o scaffold protein has neither affect on the formation of nanoparticles, nor on the ligand targeting ability. The force which drives nanoparticle formation mainly is based on electrostatic interactions between protein monomers, and this can be interrupted by the presence of high salt concentration. Moreover, when this T22 empowered nanoparticle is transferred to a high salt concentration buffer, protein naaparticles disassemble into monomers reducing its cell penetrability efficiency, proving again that size and perhaps the multivalency of the protein nanoparticle versus the monovalency of protein monomers is a key factor in receptor mediated cell targeting and penetration.