Functional characterization of REVEILLE 8 and NIGHT LIGHT-INDUCIBLE AND CLOCK-REGULATED interaction in the diurnal regulation of anthocyanin biosynthesis

Abstract

El reloj circadiano es un mecanismo celular endógeno presente en prácticamente todos los organismos. Una función clave del reloj es la sincronización del metabolismo, fisiología y desarrollo con los cambios medioambientales diurnos y estacionales generados por la rotación de la tierra sobre su propio eje. Se ha propuesto que las oscilaciones circadianas proporcionan una ventaja adaptativa al permitir que los organismos anticipen las transiciones durante el ciclo diurno/nocturno y coordinen procesos simultáneos, secuenciales o temporalmente incompatibles. En los últimos años, numerosos estudios bioquímicos, moleculares y genéticos han proporcionado una visión cada vez más completa de la función y organización circadiana en plantas. Los ritmos circadianos se generan en primera instancia mediante las regulaciones recíprocas entre componentes centrales del reloj que producen una ritmicidad en expresión génica, procesamiento de mRNA, abundancia de proteína y actividad. A pesar de estos avances, aún se dispone de muy poca información sobre los componentes y mecanismos que conectan las señales medioambientales con las rutas de salida del reloj, y en concreto, con los ritmos del metabolismo celular en plantas. El trabajo realizado durante esta Tesis Doctoral se ha centrado en el estudio del papel de los componentes circadianos REVEILLE 8 (RVE8) y NIGHT LIGHT-INDUCIBLE AND CLOCK-REGULATED (LNKs) en la regulación de la oscilación rítmica de la biosíntesis de antocianinas a lo largo del día. Al amanecer, RVE8 activa la expresión de genes de la ruta de síntesis de antocianinas mediante la unión directa a los promotores de algunos de los genes de esta ruta metabólica. La regulación positiva de RVE8 es antagonizada hacia la mitad del día por la acción represora de las proteínas LNK, tal y como se deduce del dramático incremento en la expresión de genes de antocianinas en plantas dobles mutantes lnk1/lnk2. Mediante técnicas de inmunoprecipitación de cromatina usando plantas con la expresión de RVE8 y LNKs alterada, se observa que la unión de RVE8 a los promotores disminuye en presencia de los LNK y aumenta en su ausencia, lo que pone de manifiesto un mecanismo mediante el cual las proteínas LNK antagonizan la función activadora de RVE8 sobre los genes implicados en la biosíntesis de antocianinas. Dado que RVE8 y LNKs han sido descritos como co-activadores transcripcionales de genes del reloj, nuestro estudio define un cambio en la actividad reguladora de la interacción RVE8-LNK, desde una función sinérgica activadora de genes de reloj que se expresan por la tarde, a una función represora que modula la expresión de genes implicados en la biosíntesis de antocianinas a mitad del día.

Circadian clocks sustain 24-h rhythms in physiology and metabolism that are synchronized with the day/night cycle. In plants, the regulatory network responsible for the generation of rhythms has been broadly investigated over the past years. However, little is known about the intersecting pathways that link the environmental signals with rhythms in cellular metabolism. Here, we examine the role of the circadian components REVEILLE8/LHY-CCA1-LIKE5 (RVE8/LCL5) and NIGHT LIGHT–INDUCIBLE AND CLOCK-REGULATED genes (LNK) shaping the diurnal oscillation of the anthocyanin metabolic pathway. Around dawn, RVE8 up-regulates anthocyanin gene expression by directly associating to the promoters of a subset of anthocyanin biosynthetic genes. The upregulation is overcome at midday by the repressing activity of LNK proteins, as inferred by the increased anthocyanin gene expression in lnk1/lnk2 double mutant plants. Chromatin immunoprecipitation assays using LNK and RVE8 misexpressing plants show that RVE8 binding to target promoters is precluded in LNK overexpressing plants and conversely, binding is enhanced in the absence of functional LNKs, which provides a mechanism by which LNKs antagonize RVE8 function in the regulation of anthocyanin accumulation. Based on their previously described transcriptional coactivating function, our study defines a switch in the regulatory activity of RVE8–LNK interaction, from a synergic coactivating role of eveningexpressed clock genes to a repressive antagonistic function modulating anthocyanin biosynthesis around midday.