Legionella pneumophila: Tipatge molecular i descripció de diferències genotípiques i fenotípiques entre aïllats relacionats amb casos de legionel·losis i aïllats ambientals

Abstract

Legionella és l’agent causant de la legionel·losis, una malaltia de declaració obligatòria. Quan es declara un brot de legionel·losis es realitzen estudis epidemiològic-moleculars per a la cerca del focus d’infecció. La tècnica ‘gold standard’ per aquests estudis és el PFGE, però últimament s’està implementant la tècnica SBT, una nova tècnica molecular per la tipatge de Legionella. El protocol d’aquesta tècnica va ser descrit pel EWGLI (European Working Group of Legionella Infections). En el primer objectiu de la tesis es van comparar els poders discriminatoris d’aquestes dues tècniques en un context de brots. Es van analitzar un total de 25 brots, i com a resultat final es va obtenir que el PFGE és més discriminatori que l’SBT, a més de la necessitat d’utilitzar el criteri idèntics per a la diferenciació de patrons PFGE en un brot. Com a segon objectiu, es va analitzar la diversitat dels aïllats clínics i ambientals no relacionats amb casos de la regió de Catalunya amb la tècnica SBT i anticossos monoclonals de Dresden. Es va observar que els aïllats clínics eren majoritàriament positius per l’anticòs MAb 3/1, un marcador de virulència, mentre que els aïllats ambientals eren negatius per aquest. A més, també es va observar una diferència de proporcions d’STs segons si eren ambientals o clínics. Els aïllats clínics que més casos van provocar en la regió analitzada van ser ST37-Philadelphia i ST23-Philadelphia, per altra banda, els grups més predominants en els aïllats ambientals eren ST1-Oxford, ST1-OLDA, ST284-Oxford i ST284-OLDA. Finalment, en observar aquestes diferències genotípiques dels aïllats segons si eren ambientals o clínics, es va realitzar un estudi de proteòmica comparativa per 2D-DIGE, per buscar les proteïnes responsables de la supervivència en l’ambient i capacitat d’infecció. L’estudi proteòmic es va efectuar en aïllats ambientals relacionats amb casos i aïllats ambientals no relacionats amb casos que coexistien en el focus d’infecció. En aquest estudi es va observar que la majoria de proteïnes diferencials estaven relacionades amb el metabolisme i l’estrès. Per altra banda, la proteïna majoritària de la membrana (MOMP) es va trobar com a proteïna diferencial en els dos grups, degut molt probablement a modificacions post-traduccionals diferents, segons l’origen d’aquesta. Les diferències proteiques trobades és molt probable que estiguin relacionades amb la capacitat de supervivència, persistència en l’ambient i amb la capacitat de ser transportats fins a l’hostatger humà, ja que en realitzar els estudis de citopatogenicitat no es van trobar diferències entre els grups. Les proteïnes diferencials trobades es van intentar validar per expressió gènica, per la manca d’anticossos en front a Legionella i en front a les proteïnes trobades, però aquesta tècnica no va ser útil per a la validació de proteïnes degut a que no existeix una correlació entre el nivell de proteïna expressada i el nivell d’ARN en la cèl·lula.

Legionella is the causative agent of Legionnaire’s Disease (LD), a notifiable disease. When a LD outbreak is declared, molecular-epidemiologic studies have to be done in order to find the focus of infection. Although the Gold standard method has been the PFGE, a new method described by EWGLI (European Group of Legionella Infections), the SBT, is being implemented. The first objective of this thesis was to compare the discriminatory power and usefulness of both methods in the context of 25 Legionnaires’ disease investigations. . We observed that PFGE is more discriminatory than SBT, and emphasized the need of using the indistinguishable criteria in the differentiation of PFGE profiles in outbreaks of LD. In the second objective, the genotypic diversity of clinical and environmental isolates non related to infection in the Catalunya region was assessed using SBT and monoclonal antibodies of Dresden panel. The clinical isolates were mostly positive for MAb 3/1, a virulence marker. In addition, the SBT proportion was different according to their origin (clinical or environmental). The clinical isolates that triggered more cases in the analysed region were ST37-Philadelphia and ST23-Philadelphia. On the contrary, the predominant groups of environmental isolates were ST1-OLDA, ST1-Oxford, ST284-OLDA and ST284-Oxford. Finally, with the premises that there is a high genotypic diversity among the L. pneumophila isolates and genotype distributions of L. pneumophila isolates differ between isolates associated or no-associated to clinical cases. A comparative proteomic study by 2D-DIGE was done, in order to determine the responsible proteins of survival in the environment. This study was assessed with environmental isolates related to infection and environmental isolates non-related to cases that were found in the same focus of infection. Most of the differential proteins identified were related to metabolism and stress. On the other hand, the major outer membrane protein (MOMP) was found as a differential protein in both groups, probably because of different post-translational modifications, depending on the origin of the protein. The protein differences found in this objective could be related to their survival and persistence ability in the environment, and their capacity for being transported to the human host, due to the cytopathogenic ability was tested and it was not observed any difference between both groups. The differential proteins were tested by gene expression, because of the lack of antibodies against Legionella and against these proteins. Gene expression it was not useful to validate the protein expression due to there is not a correlation between the level of expressed protein and the level of RNA in the cell.