Metabolomics and stoichiometry adapted to the study of environmental impacts on plants

Abstract

La metabolòmica ha permès importants avanços en les ciències biològiques. Un nombre creixent d'estudis ecològics han aplicat un enfoc metabolòmic per respondre a preguntes ecològiques (ecometabolòmica) durant els últims anys. El treball desenvolupat al llarg d'aquesta tesi doctoral significa un pas més en el camp de la ecometabolòmica. En el primer capítol d'aquesta tesi doctoral, hem fet l'adaptació del protocol per dur a terme la metabolòmica en estudis ecològics. En ell es descriuen en detall els procediments per al camp i de laboratori per realitzar anàlisis de metabolòmica mitjançant la Ressonància Magnètica Nuclear (RMN) especroscòpica i cromatografia líquida amb espectrometria de masses (HPLC-MS), juntament amb l'anàlisi de l'estequiometria. Aquesta millora ens ha permès combinar l'estudi d'estequiometria ecològica i metabolòmica en un sol protocol i donar una visió general del que està passant amb els organismes. En el segon i tercer capítols s’ha aplicat el protocol sobre la part aèria i arrels en l’estudi dels efectes de factors relacionats amb el canvi climàtic (sequera, escalfament, els factors de risc). Els resultats confirmen la variació metabolòmica entre la part aèria i les arrels, en les diferents estacions de l’any i en diferents tractaments d'aigua. L'anàlisi ecometabolomic simultània entre la part aèria i les arrels ha proporcionat una visió completa de tota la planta, incloent la resposta dels diferents òrgans als canvis ambientals, la resposta global fenotípica i els mecanismes metabòlics subjacents a aquestes respostes. En el quart capítol es descriu la metabolòmica de fulles d’alzina (Quercus ilex) simulant un atac dels herbívors. El perfils de RMN de les fulles del Quercus ilex canvien després de la ferida. Es va observar, un marcat augment en els metabòlits secundaris rics en carboni, del quercitol i del àcid quínic, que estan relacionats amb la via metabòlica de l'àcid shiquímic. Els resultats també confirmen que l'àcid quínic i el quercitol són presents en gran contingut en el gènere Quercus i estan involucrats en els mecanismes contra factors biòtics. Finalment, el cinquè capítol estudia les relacions entre els microorganismes epífitics i la planta. L’estudi mostra que els microorganismes que viuen a la filosfera de la fulla juguen un paper important, existeixen microorganismes dins dels òrgans de la planta i les relacions que hi ha entre l’estructura i les funcions del metabolisme intern i extern de la planta. Aquests resultats aporten un major coneixement de les relacions específiques entre les plantes i les comunitats microbianes que viuen sobre i dins d'ells.

Metabolomics has allowed significant advances in biological sciences. An increasing number of ecological studies have applied a metabolomic approach to answer ecological questions (ecometabolomics) during the last few years. The work developed throughout this PhD thesis means a further step in the field of ecometabolomics. The first chapter of results of this thesis is dedicated to the adaptation of a previously described protocol to conduct metabolomics in ecological studies. It describes in detail the procedures to follow, in the field and in the laboratory, to perform metabolomic analyses using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) coupled to stoichiometric analysis. This improvement allowed to combine the study of ecological stoichiometry and metabolomics in a single protocol and obtain a wider overview of what is happing to the organism. In the second and third chapters, the described protocol is applied to study how some climate change factors (drought, warming and irrigation) affect different organs of the plant (shoots and roots of Holcus lanatus and Alopecurus pratensis) at two different seasons. The results show a relationship between the metabolic variation observed in roots and the observed in shoots. The simultaneous metabolomic analysis of both organs of these grasses provide a complete view of the entire plant; including the response of different organs to environmental changes, the global phenotypic response and the metabolic mechanisms underlying these responses. The fourth chapter is dedicated to the study of the simulated attack to Quercus Ilex leaves by a herbivore. The results show differences in the 1H NMR metabolic profiles of the leaf before and after the wound. A marked increase in C-rich secondary metabolites, quinic acid and quercitol, which are related to the shikimic metabolic pathway, was observed. The results also confirm that quinic acid and quercitol are present in great content in the genus Quercus and they are involved in mechanisms against biotic stress. In the fifth chapter a study of the relationship between the epiphytic microorganisms and the plant host is described. This study highlights the large complexity of the episphere, the existence of internal microbial communities and the strong relationships between the structure and function of the internal and external plant metabolomes. These results warrant further study of the specific relationships between plants and the microbial communities living on and in them.