Structural analysis of nucleotide binding sites of antimicrobial ribonucleases

Abstract

Esta tesis abarca un análisis estructural y funcional de las ribonucleasas antimicrobianas. Se han analizado los centros de interacción de ligandos nucleotídicos con la RNasa A como referencia. Los estudios estructurales, estadísticos y por cristalografía de rayos X, de complejos de RNasas han permitido definir, junto a la triada catalítica, otros subcentros de interacción secundarios. La superfamilia de la RNasa A incluye miembros con funciones no necesariamente relacionadas con la actividad RNasa. En particular, las propiedades antimicrobianas aparecen en miembros con puntos isoeléctricos elevados , que explican asimismo su elevada afinidad por componentes de membrana y estabilidad. No obstante, se ha observado una baja actividad RNasa, probablemente debido a modificaciones en el alineamiento del sustrato. Se han analizado los patrones de reconocimiento y unión de sustratos nucleotídicos para caracterizar mejor las ribonucleasas citotóxicas de secreción mediante estudios estadísticos generales con complejos estructurales con mono- y dinucleótidos, realizando asimismo una comparativa con las particularidades de familias seleccionadas de endorribonucleasas representativas. Se han establecido modelos generales de interacción entre proteínas y nucleótidos y se han identificado los aminoácidos y átomos presentes en estas interacciones, definiéndose los motivos tridimensionales para los grupos fosfato, ribosa y bases nitrogenadas dentro de la superfamilia de la RNasa A. Junto a la triada catalítica, conservada en el centro activo, se ha visto una variabilidad en los subcentros secundarios, de acuerdo con los patrones de unión preferenciales de las RNasas, alineamiento y especificidad de sustrato o eficiencia catalítica variable. Estos resultados se han completado con predicciones por modelado molecular y comparaciones evolutivas por alineamiento de secuencia y solapamiento estructural. Con una comparación final con la superfamilia de la RNasa T1 (RNasas microbianas) se han analizado las características comunes y particulares para aplicarlas al reconocimiento de biomoléculas polianiónicas y configurar un punto de partida para el diseño de nuevos fármacos. Finalmente, se han estudiado, por cristalografía de rayos X, distintas RNasas recombinantes nativas (RNasa A, RNasa 3, RNasa 6), así como variantes mutantes, expresadas en un sistema procariota de alto rendimiento. Se han resuelto sus estructuras cristalinas. En particular, el estudio estructural de la ribonucleasa 6 humana (RNasa k6), el primero para el enzima, supone el punto de partida para posteriores análisis de interacciones con potenciales sustratos nucleotídicos y otros ligandos relacionados. Por otra parte, se ha cristalizado un mutante de RNasa A (RNasa A/H7H10), en complejo con 3’-CMP, cuyo centro de unión de fosfatos p2 se ha convertido en un segundo centro activo, ocasionando cambios estructurales próximos. Con un segundo complejo de RNasa A con 3’-CMP, obtenido a resolución atómica, se ha realizado un análisis comparativo más detallado, en comparación con complejos similares a menor resolución, junto con un estudio de cada subcentro en relación al complejo de RNasa A mutante, permitiendo explicar las propiedades catalíticas del mutante. La observación del estado de protonación de los residuos del centro activo ha proporcionado información adicional sobre el mecanismo de catálisis. A continuación se han cristalizado dos mutantes de la RNasa 3/ECP (ECP/H15A, H128N). Los estudios estructurales confirman los estudios cinéticos previos sobre la abolición de la actividad catalítica. Adicionalmente, dos cristales de ECP nativa se utilizaron para la comparación estructural de sendas formas cristalográficas, cadenas laterales o centros de reconocimiento de aniones. Además, con las estructuras de RNasa A, RNasa 3/ECP y RNasa 6 con iones sulfato se compararon los centros de reconocimiento del anión, análogo a los grupos fosfato de nucleótidos. Se ha confirmado la mayor afinidad de la ECP, y se han identificado las regiones potenciales de reconocimiento de nucleótidos o derivados heterosacáridos.

This thesis encompasses the structural and functional analysis of antimicrobial ribonucleases. Nucleotide-type ligand interaction sites have been analysed using RNase A as a reference protein. RNase complexes were analysed by statistical structural analysis and X-ray crystallography. Together with the catalytic triad, other secondary interaction subsites were also defined at the protein surface. The RNase A superfamily embraces ribonucleases with diverse functions not necessarily related to RNase activity. In particular, antimicrobial properties are ascribed to members with high isoelectric point values, which also explain their stability and high affinity to membrane components. However, a noticeably lower RNase activity is seen for cationic RNases owing to the lack of key residues important for the correct substrate alignment. The different nucleotide-type substrate binding and recognition patterns were deduced from an overall structure complex statistics’ analysis and compared to the particular traits of selected families of representative endoribonucleases . A large amount of mono- and dinucleotide protein complexes was analysed. The results provided a general model of protein-nucleotide interactions for cytotoxic endoribonucleases. The identification of amino acids and atoms frequently involved in the recognition interactions defined three-dimensional motifs for phosphate, ribose and bases in the RNase A superfamily. Together with the conserved catalytic triad at the active site, residue variability is commonly observed throughout the secondary binding subsites, in agreement with the RNase preferential binding patterns, the different alignment capability, substrate specificity and variable catalytic efficiency. Results were complemented with molecular modelling predictions and evolution comparisons by sequence alignment and structural overlapping. A final side-by-side comparison with the microbial RNase T1 superfamily has allowed an analysis of the common and particular features of substrate recognition processes, thereby building a general interaction architecture applicable to recognition for polyanionic biomolecules that may set a structural basis for the design of new drugs. Additionally, structural studies by X-ray crystallography were carried out. Recombinant wild-type RNases (RNase A, RNase 3, RNase 6) and mutant variants were expressed and purified in a high-yield prokaryotic system andtheir crystal structures were solved. In particular, a crystallisation condition has been discovered for human RNase 6. We report here the first crystal structure of RNase 6, which sets the basis for further analysis of interactions with nucleotide molecules and other putative ligands. On the other hand, the structural analysis of an RNase A mutant (RNase A/H7H10), where the secondary phosphate binding site p2 has been converted into a second active site, in complex with 3’-CMP, enabled the visualisation of induced neighbouring conformational changes. A second RNase A – 3’-CMP complex, obtained at atomic resolution, has enabled a more detailed comparative analysis with lower-resolution protein-nucleotide complexes together with a side-by-side study of subsite environments with the mutant complex, explaining the mutant catalytic properties. The additional visualisation of the protonation state of the active site residues has also provided information about the mechanism of catalysis. Following, two RNase 3/ECP active site mutants (ECP/H15A, ECP/H128N) were crystallised. Structural studies confirmed the conservation of the protein overall three dimensional structure together with previous kinetic experiments related to the abolished catalytic activity. Also, two native ECP crystals obtained by two distinct crystallization conditions were used for a comparison of the different unit cell packing, residue side chain variability and anion recognition sites. Finally, the structures of RNase A, RNase 3/ECP and RNase 6 with bound sulphate anions were compared, and their putative anion recognition sites characterized. The comparison of the binding subsites confirmed the higher affinity of RNase 3/ECP for sulphate/ phosphate anionsand may lead to the identification of protein regions prone to host nucleotides or heterosaccharide compounds.