Interacción de las neurotoxinas clostridiales con los receptores de neurotrofinas: identificación de TrkB como receptor proteico de la toxina tetánica

Abstract

La toxina tetánica (TeNT) es una potente neurotoxina clostridial causante de la enfermedad del tétanos. Actúa en el sistema nervioso periférico y central bloqueando la neurotransmisión inhibitoria y causando una parálisis espástica del músculo. Su extrema neuroespecificidad viene determinada por la interacción de su dominio carboxilo terminal (Hc TeNT) con las membranas neuronales mediante un mecanismo de receptor dual. Primeramente interacciona con los polisialogangliósidos, presentes en gran cantidad en la membrana plasmática, y en segundo lugar con un receptor proteico de alta afinidad que permite su endocitosis en la neurona. Aunque aún se desconoce cuál es este receptor proteico, se ha descrito que la TeNT comparte la misma ruta endocítica que las neurotrofinas y sus receptores. Las neurotrofinas son una familia de factores de crecimiento que regulan el desarrollo, el mantenimiento y la función del sistema nervioso. La interacción con sus receptores Trk (TrkA, TrkB y TrkC) y p75NTR desencadena la activación de diversas vías de señalización como la vía PI3K/Akt, la Ras/MAPK y la PLCγ/PKC, que derivan en la inducción de la supervivencia neuronal y la diferenciación. El Hc TeNT es capaz de activar a estos receptores de neurotrofinas, así como a las vías de señalización dependientes de ellos, provocando un efecto neuroprotector en distintos modelos celulares sometidos a estrés. Basándonos en estas premisas proponemos que la TeNT podría actuar sobre las neuronas mimetizando a las neurotrofinas, uniéndose a sus receptores y aprovechando su maquinaria de transporte retroaxonal para su proceso infectivo. En este trabajo se presentan evidencias que identifican al receptor TrkB como receptor proteico para la TeNT. El Hc TeNT es capaz de unirse a un péptido derivado de un dominio extracelular de TrkB y de inducir la fosforilación de éste receptor, propiedades que parecen debilitarse al mutar tres residuos de Hc TeNT en la zona de unión teórica. También compite con su agonista nativo por la unión a membranas neuronales y por la internalización junto a TrkB. Ambas moléculas además localizan conjuntamente in vivo en las uniones neuromusculares y en las motoneuronas. Centrándonos en el efecto neuroprotector observado en Hc TeNT, nos proponemos también estudiar la respuesta de la célula frente al tratamiento con neurotrofinas y con Hc TeNT después de un estímulo apoptótico, para determinar qué receptores participan, qué vías de señalización se activan y la implicación de la esfingomielinasa neutra (nSMasa) en el proceso. La nSMasa es activada por el receptor p75NTR e hidroliza la esfingomielina presente en las membranas generando ceramida, que actúa como segundo mensajero interviniendo en procesos tan dispares como la apoptosis o la supervivencia. Se ha observado que las neurotrofinas promueven la viabilidad celular actuando a través de los receptores Trk, de forma dependiente de los niveles basales de nSMasa pero no mediante el incremento de la actividad de ésta. La respuesta de supervivencia inducida por el Hc TeNT también depende de nSMasa, ya que al inhibirla o silenciarla anula este efecto. La capacidad del Hc TeNT de pasar del SNP hasta el SNC mediante saltos transinápticos, así como sus propiedades neuroprotectoras, son características de gran interés que podrían ser aplicadas en el desarrollo y la administración de fármacos al SNC.

Tetanus neurotoxin (TeNT) is a potent clostridial neurotoxin causing tetanus disease. It acts on peripheral and CNS blocking inhibitory neurotransmission and causing spastic paralysis in the muscle. Its extreme neurospecificity is determined by the interaction of the carboxyl-terminal domain (Hc-TeNT) with neuronal membranes via a dual-receptor mechanism. TeNT first binds to polysialogangliosides, and then to a second specific protein receptor that promotes its uptake. Although this protein receptor is not known yet, it has been reported that TeNT shares the same endocytic route with neurotrophins and their receptors. Neurotrophins are a family of growth factors that regulate development, maintenance and function of nervous system. The interaction with their receptors Trk (TrkA, TrkB and TrkC) and p75NTR triggers the activation of various signaling pathways like PI3K/Akt, Ras/MAPK and PLCγ/PKC, promoting neuronal survival and differentiation. Hc TeNT activates the neurotrophin receptors, as well as several signaling pathways dependent on them, inducing a neuroprotector effect in diverse cellular models. Based on these premises, we propose that TeNT acts on neurons mimicking the neurotrophins, binds to its receptors, and uses their machinery of retroaxonal transport in its infective process. In this work we present evidences that identify TrkB as a protein receptor for TeNT. Hc TeNT binds to a TrkB extracellular domain-derived peptide and acts similar to an agonist ligand for TrkB, resulting in phosphorylation of the receptor. These properties are weakened by mutagenesis of three residues of the hypothetical interaction region in Hc TeNT. It also competes with BDNF, a TrkB native ligand, for the binding to neural membranes, and for uptake in TrkB-positive vesicles. Both molecules also are located together in vivo at neuromuscular junctions and in motor neurons. Focusing on the neuroprotective effect observed for Hc TeNT, we also intend to study the cell response to treatment with neurotrophins and Hc TeNT after apoptotic stimulus. The objective is to determine which neurotrophin receptors are involved, which signaling pathways are activated and the involvement of neutral sphingomyelinase (nSMase) in the process. SMase is activated by p75NTR receptor and hydrolyzes sphingomyelin located in the membranes obtaining ceramide, which acts as a second messenger intervening in such diverse processes as apoptosis or cell survival. We find that neurotrophins promote cellular viability through Trk receptors in a manner depending on basal nSMase but not through SMase activity enhancement. Hc TeNT also induces survival in a nSMase dependent manner, since an nSMase inhibitor or siRNA knockdown abrogates its protective effects. Hc TeNT capacity to move from SNP to the CNS as well as its neuroprotective properties are characteristics of great interest that could be applied in the development and delivery of drugs to the CNS.