Hibridació Genòmica Comparada ràpida: aplicació al Diagnòstic Genètic Preimplantacional

Abstract

El diagnòstic genètic preimplantaional (PGD) permet seleccionar, dins un programa de fecundació in vitro (FIV), embrions lliures d’alteracions cromosòmiques per a la transferència a l’úter matern. Actualment, la tècnica més freqüentment utilitzada per a aquesta finalitat és la hibridació in situ fluorescent (FISH), que tan sols permet analitzar de manera rutinària nou dels 24 tipus diferents de cromosomes existents. Una tècnica alternativa menys emprada és la hibridació genòmica comparada (CGH), que permet una anàlisi citogenètica completa de tot el cariotip. Aquesta metodologia, però, requereix un temps major que la duració del cicle de FIV per obtenir els resultats, de manera que els embrions analitzats s’han de criopreservar i transferir en un altre cicle addicional. L’objectiu d’aquest treball ha estat desenvolupar i aplicar una metodologia de CGH ràpida en què el temps d’hibridació s’ha reduït de 72 hores a 12 hores, de manera que no sigui necessària la criopreservació. Per a la seva posada a punt, s’han analitzat 32 fibroblasts aïllats de línies cel·lulars establertes (Coriel) amb alteracions cromosòmiques conegudes, el resultat de CGH ràpida dels quals ha confirmat en tots els casos la presència d’aquestes alteracions. Un cop desenvolupat el protocol de CGH ràpida, s’ha adaptat i validat per a l’anàlisi de blastòmers, emprant embrions descartats de casos de PGD mitjançant FISH amb nou sondes per als cromosomes 13, 15, 16, 17, 18, 21, 22, X i Y (FISH-9-cr). Aquesta anàlisi ha posat de manifest que les discordances entre els resultats de la CGH ràpida i els de la FISH-9-cr són degudes principalment a l’existència de mosaïcisme, però també a errors de la FISH. La CGH ràpida també s’ha utilitzat per fer l’anàlisi de 22 embrions de pacients amb edat materna avançada descartats del PGD amb FISH-9-cr. Aquest estudi ha revelat la presència d’aneuploïdies (el 38,5% de les quals no s’haurien detectat mitjançant la FISH) i d’alteracions estructurals (en el 31,8% dels embrions), així com de mosaïcisme (en el 77,3% dels embrions) en els diferents blastòmers analitzats. Un cop demostrada la seva fiabilitat, la tècnica s’ha aplicat clínicament per al cribatge d’aneuploïdies en dos casos d’edat materna avançada, dos casos d’avortaments de repetició i un cas de fallades repetides d’implantació, en els quals s’ha obtingut una taxa d’implantació dels embrions transferits del 60%. Prèvia comprovació que la CGH ràpida era capaç de detectar desequilibris parcials de cromosomes amb un límit de resolució de 10-20Mb, aquesta metodologia s’ha aplicat en el PGD de portadors de translocacions cromosòmiques Robertsonianes (tres casos, quatre cicles de FIV-PGD), recíproques (dos casos, tres cicles de FIV-PGD) i un cas d’una doble translocació (tres cicles de FIV-PGD), en els quals s’ha obtingut un elevat èxit de diagnòstic i dos embarassos. En aquests casos, la CGH ràpida permet estudiar la segregació dels cromosomes implicats en la reorganització, alhora que la resta de cromosomes de la cèl·lula. La variant de CGH desenvolupada, doncs, permet estudiar tots els cromosomes de la cèl·lula i detectar-hi tant alteracions numèriques com estructurals en un sol procediment que, degut a la reducció del temps d’hibridació, és compatible amb la transferència en fresc dels embrions seleccionats. Per tant, la seva implementació pot incrementar la taxa d’implantació dels embrions transferits després del PGD.

Preimplantation genetic diagnosis (PGD) concurrent to in vitro fertilization (IVF) allows for the selection of embryos free of chromosomal abnormalities for transfer into the mother uterus. Nowadays, the technique most frequently used for this purpose is fluorescent in situ hybridization (FISH), which routinely allows for the study of only nine of the 24 existing chromosomes. Comparative genomic hybridization (CGH), although applied less frequently, is an alternative approach which permits a comprehensive cytogenetic study of the full karyotype. This method, nevertheless, requires a time greater than the length of the IVF cycle to get the results, so the embryos analyzed must be cryopreserved and transferred in a subsequent additional IVF cycle. The objective of this work was to develop and apply a short-CGH methodology in which the hybridization time is reduced from 72 hours to 12 hours, so that cryopreservation of biopsied embryos is no necessary. Thirty-two fibroblasts isolated from established cell lines (Coriel) with known aneuploidies have been used to develop the short-CGH protocol, obtaining results that confirmed the presence of these aneuploidies in all the studied cells. Subsequently, the method was adapted and validated for the analysis of blastomeres, using discarded embryos from PGD by FISH with nine probes for chromosomes 13, 15, 16, 17, 18, 21, 22, X and Y (FISH-9-cr). The short-CGH analysis revealed that the discordances between short-CGH results and FISH-9-cr results are mainly due to the existence of mosaicism, but also to FISH errors. The short-CGH approach has also been used for the analysis of 22 embryos from advanced maternal age patients, discarded by FISH-9-cr PGD. This study detected aneuploidies (38.5% of which could not have been detected by FISH), structural errors (in 31.8% of the embryos) and mosaicism (in 77.3% of the embryos) among the analysed blastomeres. Once its reliability was proven, this technique has been clinically applied for aneuploidy screening in two advanced maternal age cases, two recurrent miscarriage cases and a repeated implantation failure case, allowing a 60% implantation rate. After checking that short-CGH is capable of detecting partial chromosomal imbalances with a resolution limit of 10-20Mb, this approach has been applied in PGD for chromosomal Robertsonian translocation carriers (three cases, four IVF-PGD cycles), reciprocal translocation carriers (two cases, three IVF-PGD cycles) and a double translocation carrier (three IVF-PGD cycles), in which high diagnosis rate and two pregnancies have been achieved. In these cases, short-CGH allows for the study of the chromosomes involved in the reorganization simultaneously to the analysis of the remaining complement chromosomes. In conclusion, the developed CGH variant permits the study of the full karyotype, detecting both numerical and structural chromosomal abnormalities in a single process that, due to the reduction of the hybridization period, is compatible with fresh transfer of the selected embryos. Therefore, its implementation may improve the implantation rate of the transferred embryos after PGD.