Procarboxipeptidasa A porcina: procés d'activació i estructura primària del segment alliberat durant la conversió del zimogen en enzim actiu. Desenvolupament de mètodes analítics complementaris

Abstract

Es coneix com a segment d’activació de la procarboxipeptidasa A (PCPA) al fragment proteic situat a l’extrem N-terminal de la molècula que és separat de l’enzim actiu mitjançant activació del zimogen per proteòlisi limitada. Aquest treball té el seu fonament en l’estudi de l’estructura primària i del procés de degradació d’aquest segment d’activació durant l’activació del zimogen.. El coneixement previ sobre aquests fragments o dominis proteics era escàs a l’inici del treball. La seva llargada – aproximadament 100 residus – li conferia un interès intrínsec donat que obligava a un procés de seqüenciació i a la prèvia posada a punt d’un mètode d’anàlisi d’aminoàcids que també constitueix part del cos d’aquesta tesi. Aquest mètode es basa en la derivatització pre-columna amb clorur de dabsil i permet l’anàlisi de tots els aminoàcids proteïnogènics amb elevada reproduïbilitat i en un temps d’anàlisi estàndard de 25 min. L’estructura primària del segment d’activació de 94 aminoàcids és altament homòloga amb la d’altres espècies ja seqüenciades i presenta una elevada proporció de residus acídics i hidrofòbics. Prediccions d’estructura secundària fetes a partir de la seqüència indiquen una estructura globular compacta amb elevada proporció d’hèlix α. La PCPA porcina es presenta en forma monomèrica i en forma de complex binari amb la proproteasa E (PPE). Es va comprovar que les dues formes de PCPA són idèntiques quant a pes molecular, llargada del segment d’activació, mapes peptídics dels mateixos i activació tríptica. Tanmateix, la subunitat PPE es comporta com un modest inhibidor de l’activitat CPA, el que es reflecteix en el procés d’activació. Així, en el cas del complex binari, es produeix una inhibició inicial seguida d’una acceleració en la generació d’activitat que és probablement la conseqüència de la pertorbació inicial i la col·laboració posterior de la PPE en el procés d’activació proteolítica. Tant en la proteïna monomèrica com en el complex l’aparició del segment d’activació primari és immediata a l’inici de l’activació tríptica. Per tant, les diferències en les cinètiques i corbes d’activació són explicables a partir d’interaccions diferencials amb el segment en procés de degradació. El seguiment del procés d’activació tríptica mitjançant tècniques de HPLC i electroforesi permet observar un clar paral·lelisme entre l’aparició d’activitat i la degradació del segment, la qual es produeix de manera gradual a partir del seu extrem C-terminal. Les nostres anàlisis permeten proposar la seqüencialitat dels talls tríptics i fer una aproximació sobre les zones accessibles a l’estructura terciària, demostrant a la vegada la col·laboració de la pròpia CPA en el seu procés d’activació.

Se denomina segmento de activación de la procarboxipeptidasa A (PCPA) al fragmento proteico situado en el extremo N-terminal de la molécula y que se separa de la enzima mediante activación del zimógeno por proteólisis limitada. Este trabajo se basa en el estudio de la estructura primaria y del proceso de degradación de este segmento de activación durante la activación del zimógeno. El conocimiento previo sobre estos fragmentos o dominios proteicos era escaso al inicio del trabajo. Su longitud – aproximadamente 100 residuos – le confería un interés intrínseco puesto que obligaba a un proceso de secuenciación y a la previa puesta a punto de un método de análisis de aminoácidos. Este método se basa en la derivatización pre-columna con cloruro de dabsilo y permite el análisis de todos los aminoácidos proteinogénicos con elevada reproducibilidad, en un tiempo de análisis estándar de 25 min. La estructura primaria del segmento de activación de 94 aminoácidos es altamente homóloga a la de otras especies ya secuenciadas y presenta una elevada proporción de residuos acídicos e hidrofóbicos. Predicciones de estructura secundaria hechas a partir de la secuencia indican una estructura globular compacta con elevada proporción de hélice α. La PCPA porcina se presenta en forma monomérica y en forma de complejo binario con la proproteasa E (PPE). Se comprobó que las dos formas de PCPA son idénticas en su peso molecular, longitud del segmento de activación, mapas peptídicos de los mismos y activación tríptica. La subunidad PPE se comporta como un modesto inhibidor de a actividad CPA, lo que se refleja en el proceso de activación. Así, en el caso del complejo binario, se produce una inhibición inicial seguida de una aceleración en la generación de actividad que es probablemente la consecuencia de la perturbación inicial y la colaboración posterior de la PPE en el proceso de activación proteolítica. Tanto en la proteína monomérica como en el complejo, la aparición del segmento de activación primario es inmediata al inicio de la activación tríptica. Por tanto, las diferencias en las cinéticas y curvas de activación son explicables a partir de interacciones diferenciales con el segmento en proceso de degradación. El seguimiento del proceso de activación tríptica mediante técnicas de HPLC y electroforesis permite observar un claro paralelismo entre la aparición de actividad y la degradación del segmento, la cual se produce de manera gradual a partir de su extremo C-terminal. Nuestros análisis permiten proponer la secuencialidad de los cortes trípticos y hacer una aproximación sobre les zonas accesibles en la estructura terciaria, demostrando a la vez la colaboración de la propia CPA en su proceso de activación.

The activation segment of procarboxypeptidase A (PCPA) is the fragment located at the molecule’s N-terminal which is severed from the enzyme by limited proteolysis. This work is aimed at the study of its primary structure and its degradation process during proenzyme activation. Previous knowledge on this type of fragments or domains was scarce until recently. Its length, approx. 100 residues, endowed it with an intrinsic interest both to elucidate its sequence and to work out a method of amino acid analysis not previously settled in our laboratory. This method is based on pre-column derivatization with dabsyl chloride and allows for the highly reproducible analysis of all proteinogenic amino acids in a standard time of 25 min. The primary structure of the 94-residue activation segment is highly homologous to those of other already sequenced species and displays a high proportion of acidic and hydrophobic residues. Secondary structure predictions indicate the presence of a compact globular structure with a considerable proportion of α helix. Porcine PCPA is found in monomeric and complex form; in the latter case as a binary complex with proprotease E (PPE). Both PCPA forms are identical in molecular weight, length and peptide maps of the activation segment and in their tryptic activation process. The PPE subunit behaves as a modest inhibitor of CPA activity which has a consequence on the activation process. Thus, in the case of the binary complex, an initial inhibition is followed by an acceleration of activity generation that is probably the consequence of both an initial perturbation and a later collaboration of PPE in the proteolytic activation process. Both in the monomeric and the complexed protein the release of the primary activation segment is immediate to the start up of the tryptic activation, indicating that the differences in the kinetics and activation curves may be regarded as the consequence of differential interactions with the dynamically degrading segment. The follow-up of the activation process by means of HPLC chromatography and electrophoresis allows for the observation of a clear correspondence between the increase in enzyme activity and the degradation of the activation segment, which is gradual from its C-terminus. Our analyses lead us to propose a sequence of events for the tryptic hydrolysis and a possible map of accessible areas in the tertiary structure, besides confirming the collaboration of CPA in its own activation process.