Membranes polimèriques enzimàtiques. Aplicació al tractament de biomassa vegetal per a la recuperació d'oligosacàrids

Abstract

Actualment, els processos orientats a la reducció de residus i l'obtenció de productes d'alt valor afegit es presenten com una fita amb perspectives prometedores. En aquesta tesi es dissenyen membranes polimèriques selectives per al tractament de materials lignocel·lulòsics. L'enzim endo-1,4-?-xilanasa II, que hidrolitza enllaços 1,4-?-glicosídics a l'esquelet del xilà, s'immobilitza a membranes per enllaç covalent, per a recuperar oligosacàrids de la hidròlisi d'aquest polímer. L'interès d'immobilitzar enzims en suports polimèrics rau en la reducció del cost i la simplificació del procés global, a conseqüència de la possibilitat de reutilizar l'enzim immobilitzat mentre conservi la seva activitat catalítica.<br/>S'investiguen dos tipus de membranes polimèriques i mètodes de immobilització per enllaç covalent entre grups funcionals de l'enzim i del suport. Les primeres són membranes d'acrilat de polisulfona (ACPS). La immobilització de la proteïna es confirma per anàlisi de aminoàcids per HPLC i comparació amb l'anàlisi de la proteïna en dissolució. Les altres membranes (N25) estan constituïdes per polímers monolítics. Les propietats físiques i químiques d'aquests materials depenen de la selecció i de la quantitat dels components de la dissolució precursora de membrana. S'optimitza aquesta composició de la dissolució precursora per a obtenir la màxima activitat enzimàtica.<br/>Es comparen diferents procediments d'immobilització per ambdues membranes per a avaluar la capacitat d'immobilització. Les membranes ACPS retenen més enzim que les N25, tot i que no comporta major activitat enzimàtica, ja que aquesta depèn de l'estabilització de la proteïna immobilitzada en cada cas. Es proposa l'ús de tècniques de biologia molecular per a dur a terme la immobilització dirigida, i evitar el bloqueig del centre actiu de les molècules d'enzim per unió directa amb el suport per aquest punt. La influència de la immobilització en paràmetres d'activitat enzimàtica (pH i temperatura) s'estudia i es compara amb els paràmetres òptims de l'enzim lliure. Els valors de la constant de Michaelis-Menten no difereixen significativament entre l'enzim lliure i immobilitzat, de manera que l'afinitat del catalitzador respecte dels substrats considerats roman inalterada un cop immobilitzat. <br/>Per a la caracterització física de las membranes, s'utilitzen diferents tècniques, com la microscòpia electrònica d'escombrat (SEM), a partir de la qual s'observen diferències de simetria i porositat entre els dos tipus de membranes. Per microscòpia de força atòmica (AFM) no es detecten diferències en un mateix tipus de membranes segons continguin o no enzim immobilitzat. De la determinació de fluxos d'aigua pura, els valors més alts s'obtenen amb les membranes N25. A partir de mesures d'adsorció-desorció de gasos s'observa que les membranes N25 tenen major àrea superficial i distribucions de porus amb major diàmetre mitjà. Les mesures d'angle de contacte evidencien un major caràcter hidrofílic de les membranes N25 que les ACPS, que augmenta en incrementar la quantitat d'enzim immobilitzat.<br/>Les membranes s'apliquen al tractament de biomassa, emprant dos mòduls de membrana diferents. Solament s'obté separació dels productes del substrat inicial quan s'utilitza el mòdul de filtració frontal aplicant pressió. La major concentració de productes d'hidròlisi s'obté amb les membranes N25 en el tractament de Birchwood xylan, malgrat que no és possible reutilitzar-les en una segona hidròlisi consecutiva amb nova dissolució de substrat. En canvi, en tractar substrats procedents de closca de moresc, les membranes ACPS es poden reutilitzar, malgrat que la concentració de productes és inferior que en la primera hidròlisi. <br/>Els productes obtinguts s'analitzen per un mètode colorimètric, per electroforesi capil·lar, per cromatografia per permeació en gel, i per ionització per làser assistida per matriu amb analitzador de temps de vol (MALDI-TOF-MS). L'última permet determinar el grau de polimerització dels productes, obtenint com a majoritari xilotriosa.<br/>Finalment s'avalua el procés global i es presenten propostes de millora.

Nowadays, processes oriented to waste reduction and recovery of high added value products are a promising target. In this thesis, enzymatic polymeric membranes are designed for the treatment of vegetal biomass waste like lignocellulosic materials. The enzyme endo-1,4-?-xylanase II, which hydrolyzes 1,4-?-glycosidic linkages of the xylan backbone, is immobilized in the membranes through a covalent bond in order to recover oligosaccharides by xylan hydrolysis. The interest for the attachment of enzymes on polymeric supports relies on the reduction in the cost and the simplification of the process, comparing to processes with enzymes in solution, due to the ability for reusing the enzyme for as long as its catalytic activity is maintained.<br/>Two different polymeric membranes and covalent immobilization methods (between functional groups of the enzymes and groups in the support) are investigated. The first consist on polysulfone acrylate (ACPS). Protein immobilization is confirmed by HPLC by comparing the amino acid content in ACPS membranes with the amino acid content in the free xylanase solution. The other membranes (N25) are based in monolithic polymers. Their physical and chemical characteristics can be finely tuned by selecting the appropriate constituents and their content in the precursor solution. The composition of different membranes, regarding the amount of three components in the membrane precursor solution is optimized to obtain the highest catalytic activity.<br/>Different enzyme immobilization conditions in both membranes are compared to evaluate their immobilization capacity. ACPS membranes retained more enzyme than N25, although this does not imply higher enzymatic activity, since it depends on the stabilization of the immobilized protein. The use of molecular biology techniques is proposed to avoid the catalytic site blocking, by performing site directed immobilization. The influence of the immobilization in enzymatic activity parameters (temperature and pH) is studied for both membranes and compared with data for the free enzyme. Regarding the enzyme kinetic parameters, KM values for free and immobilized enzyme in the two membranes are close, meaning that the enzyme affinity for the substrates considered remains intact. The immobilization time is optimized and the enzymatic activity stability of the immobilized enzymes is studied. <br/>Different techniques are used for the physical characterization of membranes. Scanning Electron Microscopy (SEM) showed differences in symmetry and pore structure between membrane types. No significant differences are observed when comparing Atomic Force Microscopy (AFM) images of membranes without/with enzyme. Pure water fluxes are determined and N25 membranes exhibit higher fluxes than ACPS. From gas adsorption-desorption is observed that N25 membranes have higher surface area and pore distributions with higher average pore diameter than ACPS. Contact angle measurements show higher hydrophilic character for N25 than ACPS, and hydrophilicity increases with immobilized enzyme in both membranes.<br/>The enzymatic membranes are used in biomass treatment with two membrane modules. Separation of the products from the initial substrate is achieved only with the dead-end module. By using N25 membranes higher yields of hydrolysis products (expressed as xylose) from enzymatic hydrolysis of Birchwood xylan (0.650 µmol/ml) are obtained, compared to ACPS (0.150 µmol/m). It is not possible to reuse N25 membranes in a consecutive hydrolysis with new substrate. In contrast, when treating samples proceeding from the direct treatment of corn shells, ACPS membranes can be reused, although the product concentration is lower than during the first hydrolysis. <br/>The hydrolysis products are analyzed by a colorimetric assay, Capillary Electrophoresis (CE), Gel Permeation Chromatography (GPC) and the degree of polymerization is determined by Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS). Almost in all samples the unique observed specie is xylotriose.<br/>Finally, a global evaluation and improvements to be considered during future research are presented.