Defective sarcoplasmic reticulum-mitochondria communication in aged heart and its effect on ischemia and reperfusion injury

Abstract

Las alteraciones mitocondriales están vinculadas a la mayor vulnerabilidad de padecer enfermedades durante el envejecimiento. La edad avanzada es un factor determinante de la incidencia y gravedad de la cardiopatía isquémica. Estudios preclínicos sugieren la existencia de un daño celular intrínseco, por mecanismos no del todo establecidos, que contribuye a un incremento de la susceptibilidad del miocardio senescente al daño isquémico. Esta tesis investiga el papel de la comunicación mitocondria-retículo sarcoplásmico (RS) en el deterioro funcional de los cardiomiocitos durante el envejecimiento. El estudio ecocardiográfico ha demostrado que la función cardiaca en el reposo se mantiene preservada en los animales viejos. No se han observado cambios debidos a la edad en el potencial de membrana mitocondrial ni en el consumo de oxígeno en condiciones de reposo en mitocondrias aisladas de corazones de ratón. El consumo de oxígeno inducido por ADP ha revelado que las mitocondrias interfibrilares de corazones viejos no alcanzan el nivel respiratorio máximo. Análisis proteómicos de segunda generación han demostrado un aumento de la oxidación de proteínas mitocondriales relacionado con el envejecimiento. Esta tesis ha investigado el posible efecto de la edad sobre la capacidad de las mitocondrias para captar calcio. En cardiomiocitos la captación mitocondrial del calcio procedente del RS se ha visto reducida de forma significativa en el envejecimiento. Esta disminución de la captación de calcio mitocondrial se asoció a una reducida capacidad de regeneración de NAD(P)H y a un incremento de la producción de ROS mitocondriales en cardiomiocitos viejos. Ensayos de inmunofluorescencia y de ligación por proximidad han revelado una comunicación defectuosa entre la mitocondria y el RS en cardiomiocitos de corazones senescentes. La desestructuración de las uniones entre el RS y la mitocondria con colchicina fue capaz de reproducir el efecto de la edad sobre las alteraciones en el manejo/transferencia de calcio entre ambos orgánulos en cardiomiocitos jóvenes. La segunda parte de este trabajo investiga el impacto potencial de las alteraciones mitocondriales sobre los efectos adversos del envejecimiento en el daño por isquemia y reperfusión (IR). Los corazones aislados y perfundidos de ratones viejos sometidos a IR desarrollaron mayor rotura sarcolemal y tamaño de infarto, junto con un retraso significativo del desarrollo del rigor isquémico. Los cardiomiocitos viejos sometidos a isquemia, desarrollaron una caída más rápida del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) junto con un retraso paradójico en la aparición del rigor. La tasa de recuperación transitoria del ΔΨm durante los primeros minutos de isquemia, debida a la actividad reversa de la FoF1-ATPsintasa, se encontró significativamente disminuida en cardiomiocitos viejos. El análisis proteómico ha demostrado un aumento de la oxidación de diferentes subunidades de la FoF1-ATPsintasa asociado al envejecimiento. La alteración del ΔΨm observado en los cardiomiocitos viejos se asoció a una menor captación de calcio mitocondrial durante la IR. A pesar de esto, el desarrollo de permeabilidad transitoria (mPT) fue mayor en los cardiomiocitos senescentes y este efecto se correlacionó con una mayor hipercontractura y muerte celular en reperfusión. Por lo tanto, el desarrollo de una comunicación defectuosa entre el RS y la mitocondria durante el envejecimiento produce un intercambio ineficiente de calcio entre ambos orgánulos, que contribuye al desajuste en la demanda/aporte de energía y a un aumento consiguiente del estrés oxidativo. La oxidación de la FoF1-ATPsintasa se asocia a una alteración de su funcionamiento y a un incremento de la sensibilidad de la mitocondria para desarrollar mPT. Debido al modelo recientemente propuesto según el cual la FoF1-ATPsintasa forma parte del mPTP, es posible especular que la oxidación de esta enzima está asociada al aumento del daño por IR en el miocardio senescente.

Mitochondrial alterations are critically involved in the increased vulnerability to disease during aging. On the other hand, aging is a major determinant of the incidence and severity of ischemic heart disease. Preclinical information suggests the existence of intrinsic cellular alterations that contribute to ischemic susceptibility in senescent myocardium, by mechanisms not well established. The first part of this thesis investigates the contribution of mitochondria-sarcoplasmic reticulum (SR) communication in the functional decline of cardiomyocyte during aging. Echochardiographic analysis of aging mice (>20 months) showed a rather preserved cardiac contractile function in resting conditions respect to young mice (5-6 months). ATP/phosphocreatine were preserved in hearts from old mice as quantified by RMN spectroscopy. In isolated mitochondria from young and old mouse hearts, mitochondrial membrane potential and resting O2 consumption were similar in both groups. However, stimulation of O2 consumption after the addition of ADP resulted in a partial failure of interfibrillar mitochondria from aged hearts to achieve maximal respiratory rate. Second generation proteomics disclosed an increase of mitochondrial protein oxidation in advanced age. Because both energy production and oxidative status are regulated by mitochondrial calcium, this work further investigated the effect of age on mitochondrial calcium uptake. While no age-dependent differences were found in calcium uptake kinetics in isolated mitochondria, in which the contribution of other organelles and sarcolemma is absent, mitochondrial calcium uptake secondary to SR calcium release was significantly reduced in cardiomyocytes from old hearts. Reduced mitochondrial calcium uptake in aging cardiomyocytes was associated with decreased NAD(P)H regeneration and a concomitant increase of mitochondrial ROS production manifested only when cells were exposed to high frequency electrical stimulation. Immunofluorescence and proximity ligation assay identified defective communication between mitochondria and SR in cardiomyocytes from aged hearts. Functional analysis of calcium handling in fluo-4 loaded cardiomyocytes disclosed an altered pattern of RyR gating properties. The observed defects in SR calcium transfer and in calcium handling could be reproduced in young cardiomyocytes after interorganelle disruption with colchicine, at concentrations that had no significant effect in aged cardiomyocytes or isolated mitochondria. The second part of this work investigates the potential impact of the altered mitochondrial function in the adverse effect of aging on myocardial ischemia and reperfusion (IR) injury. Isolated perfused hearts from old mice submitted to transient IR displayed an increase in hypercontracture, sarcolemmal rupture and infarct size, as compared to hearts from young mice, despite a paradoxical delay ischemic rigor contracture onset. In isolated cardiomyocytes from aging hearts submitted to IR there was a faster decline of mitochondrial membrane potential (ΔΨm) in comparison with young ones, but ischemic rigor shortening was also delayed. Transient recovery of ΔΨm observed during ischemia, secondary to the reversal of mitochondrial FoF1-ATPsynthase to ATPase mode, was markedly reduced in aging cardiomyocytes. Proteomic analysis demonstrated an increased oxidation of different subunits of FoF1-ATPsynthase. Altered bionergetics in aging cells was associated with reduced mitochondrial calcium uptake and more severe cytosolic calcium overload during both ischemia and reperfusion. Despite attenuated mitochondrial calcium overload, the occurrence of mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening, hypercontracture and cell death were increased during reperfusion in cardiomyocytes from old mice. In vitro studies demonstrated a significantly reduced calcium retention capacity in interfibrillar mitochondria from aging hearts. Thus, defective SR-mitochondria communication underlies inefficient interorganelle calcium exchange that contributes to energy demand/supply mismatch and oxidative stress in the aged heart. This may spread on an altered FoF1-ATPsynthase and increased sensitivity of mitochondria to undergo mPTP opening as important determinants of the reduced tolerance to ischemia-reperfusion in senescent myocardium. Because ATPsynthase has been proposed to conform mPTP, it is tempting to hypothesize that oxidation of ATPsynthase underlie both phenomena.