Alteraciones del gen MYC en linfomas agresivos de células B: evaluación mediante FISH, relación con la expresión proteica y valor pronóstico.

Abstract

En la presente tesis doctoral hemos estudiado diferentes aspectos metodológicos en la caracterización del gen MYC de aplicación práctica en el diagnóstico, tratamiento y valoración pronóstica de linfomas agresivos de células B, y hemos aplicado estos conocimientos metodológicos en un subgrupo de linfomas concreto: los linfomas primarios del sistema nervioso central (CNS-DLBCL). En el primer trabajo de la tesis demostramos que el gen MYC se encuentra reordenado en un subgrupo de linfomas difusos de células grandes B (DLBCL), además de linfomas de Burkitt (BL) y linfomas inclasificables de características intermedias (BCLU). La presencia de la traslocación del gen MYC se asoció a una mayor expresión proteica que puede detectarse mediante técnicas inmunohistoquímicas (70% vs. 28% en la serie global y 61% vs. 28% en DLBCL). La sobreexpresión de MYC no se correlacionó con la presencia de ganancia de copias del gen, con otros marcadores inmunohistoquímicos (CD10, BCL6, BCL2 y MUM1), el índice de proliferación celular (Ki67) o el subtipo molecular según el algoritmo de Hans. Por otro lado, observamos que un subgrupo de DLBCL sin reordenamiento del gen MYC expresa niveles proteicos elevados, los culaes deben obedecer a mecanismos alternativos al reordenamiento génico. En el segundo trabajo de la tesis comparamos los resultados obtenidos al estudiar el estado del gen MYC mediante diferentes sondas comerciales de FISH: una sonda de fusión IGH-MYC y dos sondas de separación. En los 13 casos con reordenamiento IGH-MYC, la traslocación pudo detectarse con las tres sondas evaluadas. Por el contrario, en 7 de los 13 casos (54%) con reordenamiento no-IGH-MYC (IGK-MYC, IGL-MYC o no-IG-MYC), la traslocación pudo detectarse inequívocamente con una única sonda (de separación), siendo el resultado de las otras sondas no concluyente o negativo (falso negativo). Por otro lado, 9 de los 15 casos (60%) con un patrón sugestivo de traslocación no-IGH-MYC con la sonda de fusión eran debidos a ganancia de copias del gen MYC, y no a la presencia de reordenamiento, tal y como se demostró con las dos sondas de separación (falso positivo). En base a los datos obtenidos en este estudio, proponemos una aproximación doble con el uso de una sonda FISH de fusión y otra de separación a la hora de valorar la presencia de alteraciones en la banda cromosómica 8q24. Finalmente, en el último trabajo de la tesis evaluamos el papel del reordenamiento del gen MYC junto con los genes BCL2 y BCL6 y su expresión proteica en el CNS-DLBCL y su posible valor pronóstico. En una serie de 42 CNS-DLBCL observamos unos niveles elevados de expresión del gen MYC en el 43% de los casos, y esta expresión elevada se correlacionó con una menor supervivencia global (OS). La expresión de niveles elevados de MYC no era debida a la presencia de reordenamientos del gen, ya que no se demostró reordenamiento del gen MYC en ningún caso. Los linfomas con una coexpresión de niveles elevados de MYC y BCL2 mostraron una menor OS, si bien las diferencias no fueron estadísticamente significativas. En ningún caso se detectó la traslocación del gen BCL2. El gen BCL6 se encontraba reordenado con frecuencia (44% de los casos), pero la presencia de traslocaciones no se correlacionó con el pronóstico. En conclusión, en este estudio demostramos que el CNS-DLBCL con frecuencia presenta sobreexpresión del gen MYC, y que esta sobreexpresión identifica un subgrupo de linfomas con comportamiento más agresivo. Por lo tanto, el estudio de la expresión del gen MYC mediante inmunohistoquímica podría ayudar a una valoración pronóstica más precisa en el CNS-DLBCL.

In this doctoral thesis we have studied some methodological aspects in the MYC gene characterization with clinical utility in the diagnosis, treatment and prognostic evaluation of aggressive B-cell lymphomas. Specifically, we have applied this knowledge to the study of a lymphoma subgroup: diffuse large B-cell lymphoma of the central nervous system (CNS-DLBCL) In the first study we found that some diffuse large B-cell lymphomas (DLBCLs), such as Burkitt’s lymphoma a(BL), harbored MYC gene rearrangements. MYC gene translocation was associated with higher MYC protein expression as assessed by immunohistochemistry (70% vs. 28% in the whole series and 61% vs. 28% in DLBCL cases). MYC protein expression was not related with increased MYC gene copy numbers, the other immunohistochemical markers evaluated (CD10, BCL6, BCL2 and MUM1), the proliferative index (Ki67) or the cell of origin according to Hans algorithm. Moreover, we found that some DLBCLs lacking MYC gene rearrangements show high levels of MYC protein expression, due to unknown mechanisms. In the second study, we assessed the impact of FISH probe selection in the evaluation of MYC gene rearrangement. The results obtained with one fusion IGH-MYC and two break-apart commercial probes in a series of 91 aggressive B-cell lymphomas were compared. All cases (n=13) with IGH-MYC translocation could be detected with all three probes. However, 7 of 13 cases (54%) with non-IGH-MYC (IGK-MYC, IGL-MYC or non-IG-MYC) were unambiguously detected by just one of the probes tested, whereas the other probes yielded non-conclusive or negative results (false negative). On the other hand, when the IGH-MYC fusion probe was used, 9 of 15 cases (60%) with hybridization patters suggestive of a non-IGH-MYC rearrangement were attributable to MYC copy gain rather than MYC translocation, as demonstrated by both break-apart probes (false positive). Our results indicate that detection of MYC gene rearrangement could be optimized by a two-probe approach involving the application of both IGH-MYC dual-fusion and MYC break-apart selected probes. Finally, in the third study, we evaluated the role of MYC, BCL2 and BCL6 gene status and their protein expression in a series of 42 CNS-DLBCL. We observed high MYC protein expression in 43% of cases, and this was associated with lower overall survival (OS). MYC protein expression was not related to MYC gene rearrangement, since translocation was not found in any instance. Cases with concurrent expression of MYC and BCL2 showed a lower OS, although the difference did not reach statistical significance. Translocation involving BCL2 gene was not detected in any case. The BCL6 gene was frequently translocated (44%), but it was unrelated to survival. In conclusion, we found that CNS-DLBCLs frequently show MYC protein overexpression and that its immunohistochemical detection may contribute to a more accurate risk stratification of CNS-DLBCL patients.