Contribution to lithiasic process knowledge. Characterization of physiological aspect and novel material to determine key inhibitors

Abstract

La urolitiasis es una de las enfermedades urológicas más frecuentes, que se producen tanto en los países industrializados como en vías de desarrollo. La tasa de incidencia es de hasta el 15% en hombres de raza blanca y el 6% de todas las mujeres. La recurrencia afecta aproximadamente a la mitad de los afectados. Los cálculos renales son agregados cristalinos que causan la obstrucción de la orina en el sistema colector renal, uréteres o uretra, resultando en dolor severo, sangrado o erosión local del tejido renal. La etiología del cálculo urinario formado es resultado de diferentes mecanismos que todavía no son bien entendidos. Los retos que plantea la litiasis urinarias son entre otros, mejores opciones terapéuticas, diagnóstico interdisciplinario y prevención secundaria. El propósito de esta tesis es ofrecer conocimiento a los retos mencionados utilizando nuevos métodos científicos o materiales. La tesis expone el trabajo desarrollado en tres áreas relativas a la urolitiasis: extracción de inhibidores clave de alimentos, determinación de inhibidores de fósforo mediante un nuevo material desarrollado, y el análisis de fraccionamiento isotópico de cobre de pacientes de urolitiasis En la primera sección se evalúa el uso de la extracción asistida por microondas (MAE) para extraer cuantitativamente los inhibidoresde litiasis ácido fítico (IP6) y pirofosfato (PPi) de nueces. Se escogieron nueces son un componente importante de la dieta humana, ricas en ácidos grasos poliinsaturados y tienen capacidad antioxidante Se optimizaron los parámetros: concentración del ácido utilizado para la extracción, el tiempo y la temperatura de tratamiento. También se ha evaluado la hidrólisis del ácido fítico. Los mejores resultados se obtuvieron para una mezcla de 0,52 M de H2SO4 y 0,66 M HCl a 100 °C durante 10 min. En comparación con el método de extracción convencional, MAE reduce el tiempo de extracción de 3h a 10 min obteniendo los mismos resultados de recuperación. La segunda sección de la tesis está dedicada a desarrollar un nuevo Polímero de Impresión Molecular (MIP) para adsorber y separar IP6 y PPi. En este trabajo, los polímeros han sido desarrollados utilizando tres compuesto organofosforados como plantilla, ácido fenilfosfónico (PA), Di‐ (2‐etilhexil) ácido fosfórico (DEHPA) y ácido pirofosfórico. El MIP se preparó mediante polimerización térmica utilizando N‐aliltiourea (AT) como monómero y dimetacrilato de etilenglicol (EGDMA) como agente de reticulación. Los resultados muestran que el MIP formado usando DEHPA presenta la mejor adsorción para IP6 y el proceso de adsorción es bastante rápido. El pH tiene un efecto significativo sobre el comportamiento de adsorción de IP6, PPi y fosfato por lo que utilizando diferentes concentraciones de pH IP6, PPi y fosfato pueden separarse mediante el uso del MIP en una extracción en fase sólida. La tercera parte de la tesis considera un aspecto fisiológico de la urolitiasis. En la literatura se describe al Cobre como inhibidor del crecimiento de cálculos renales y una disfunción en el metabolismo del cobre puede estar relacionado con la etiología de la enfermedad. El estudio de la relación isotópica de cobre en sangre (suero y glóbulos rojos) de pacientes urolitiásicos del área de Barcelona se analizó y comparó con controles sanos. El Cu se separó y purificó mediante cromatografía de intercambio aniónico y analizó con un multi‐colector ICP‐MS. Los resultados muestran que, para la población considerada en este estudio, tanto la concentración como la relación isotópica (65Cu/63Cu) muestran diferencias entre pacientes y controles. Aunque se necesitan más estudios con un número mayor de muestras, los resultados son alentadores en cuanto a la utilización del análisis isotópico de Cu para el estudio de la enfermedad urolitiásica.

Urolithiasis is one of the most prevalent urological diseases, occurring in both industrialized and developing countries. The incidence rate is up to 15% of white men and 6% of all women and the recurrence affect about half of those people. Kidney stones are aggregates of crystals that cause obstruction of urine flow in the renal collecting system, ureters, or urethra and result in severe pain, bleeding or local erosion of kidney tissue. The etiological diversity of urinary stone formed as a result of different mechanisms which is still not well understood. The challenges posed by urinary lithiasis demands enhanced interdisciplinary diagnostic, therapeutic options and secondary prevention. The purpose of this thesis is to offer knowledge to the previous mentioned challenges using novel scientific methods or materials. The dissertation exposes the work developed in three areas concerning urolithiasis, which embeds urolithiasis key inhibitors extraction from food, phosphorous inhibitors determination by using novel material, and copper isotopic fractionation analysis from urolithiasis patients The first section in the dissertation is devoted to the use of microwave assisted extraction (MAE) technique to quantitatively extract the two phosphorous inhibitors of urolithiasis, phytic acid (IP6) and pyrophosphate (PPi), from walnut since the existing extraction method and quantitative analysis show inconveniences. Walnuts were chosen since they are highly consumed, rich in polyunsaturated fatty acid and provide significant benefits due to the antioxidant capacity. Three main parameters were considered to optimize the condition of microwave-assisted extraction: acid content of extracting solvent, extraction time and treatment temperature. The hydrolysis of phytic acid by microwave treatment was also investigated for all the tested conditions. The extraction using mixture of 0.52 M H2SO4 and 0.66 M HCl under MAE condition (100°C, 10min) shows a better extract ability for both IP6 and PPi. Compared with the conventional acid extraction method, the microwave-assisted extraction method developed reduces extraction time from 3h to 10 min obtaining the same recovery results. The second section in the dissertation is devoted to develop a novel material based on molecular imprinted technology for selectively adsorb and separate the IP6 and PPi. In this work, polymers have been molecularly imprinted using three organophosphorus compounds as template, phenylphosphonic acid (PA), Di-(2-ethylhexyl) phosphoric acid (DEHPA) and pyrophosphoric acid. The Molecularly Imprinted Polymer, MIP, was prepared by thermal polymerization using Nallylthiourea (AT) as functional monomer and ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) as crosslinker. The batch adsorption experiments show that the MIP using DEHPA has the best specific adsorption for IP6 and the adsorption process is quite fast. The pH has a significant effect on the adsorption behavior of IP6, PPi and phosphate. Through modification of the pH of the eluting solvent, IP6, PPi and phosphate can be separated by SPE procedure using the developed MIP. The third part of the thesis considers the physiological aspect of urolithiasis. In the literature Copper has shown inhibitory effect on the growth of kidney stone and disordered in copper metabolism may be important in the aetiology of disease. The blood Copper isotope fractionation from urolithiasis patients from Barcelona area was analyzed and compared to healthy controls. The serum and red cell samples Cu isotope compositions was measured by multi-collector ICP-MS after separation and purification by anion exchange chromatography. Our results show that, for the population considered in this study, Cu concentration and Cu isotopic ratio (65Cu/63Cu) show different value between the urolithiasis patients and the healthy people. Although further studies with a larger number of samples are needed, results are encouraging as far as the use of Cu isotopic analysis for the study of urolithiasis disease.