Propietats coordinants i estructurals de la proteïna CuMT-II del cranc Callinectes sapidus: Una metal·lotioneïna amb triplets de cisteïna

Abstract

Les metal·lotioneïnes (MTs), pèptids amb una excepcional capacitat coordinant, constitueixen una gran família de metal·loproteïnes presents en gairebé tots els éssers vius. L'estudi de les propietats coordinants i estructurals de les diverses isoformes de MT és important per a aportar noves dades a la resolució de les funcions que duen a terme, fins ara relacionades amb la destoxicació de metalls pesants i l'homeòstasi de zinc i coure. <br/>En aquesta tesi doctoral s'ha estudiat la metal·lotioneïna del cranc Callinectes sapidus CuMT-II (MTC en aquest treball), per la seva atípica estructura primària dins les MTs de crustaci i per contenir triplets de cisteïna, motiu molt poc habitual en aquestes proteïnes. Aquesta MT s'ha obtingut per enginyeria genètica en medis suplementats amb zinc, amb coure i amb ambdós metalls. Els complexos metàl·lics formats en aquestes síntesis s'han caracteritzat mitjançant ESI-MS, CD, UV i ICP-AES. Així mateix, fent ús d'aquestes tècniques, s'ha aprofundit en les propietats coordinants de MTC mitjançant la reconstitució de la forma demetal·lada apoMTC i la valoració de ZnMTC i apoMTC amb diversos ions metàl·lics. Finalment, s'ha estudiat per RMN la proteïna reconstituïda amb 113Cd.<br/>Amb aquests estudis s'ha establert que per a una millor estructuració amb coure, aquesta proteïna també ha de contenir ions zinc i que, a diferència del que estava àmpliament acceptat per a altres metal·lotioneïnes, l'estequiometria dels complexos que estableix MTC amb Cd(II) no s'ajusta exactament amb la que estableix amb Zn(II). Els treballs de RMN han permès establir que l'estructuració de MTC amb ions cadmi té lloc en dos dominis, cadascun dels quals coordina 3 - 4 ions Cd(II).<br/>Addicionalment, s'ha aportat noves dades sobre el mecanisme de funcionament de les MTs en el seu paper antiinflamatori en lesions cerebrals, mitjançant l'estudi funcional dels dominis de MT-1 de mamífer en ratolins criolesionats, knockout per MT-1/-2 (amb els gens de MT-1 i MT-2 inactivats), concloent que el domini &#946; presenta unes millors condicions antiinflamatòries.

Metallothioneins (MTs), peptides with an exceptional heavy metal coordination capacity, constitute a superfamily of ubiquitous metalloproteins. Study of MTs metal coordinating properties and their structure is necessary to contribute to the determination of their physiological functions. Nowadays, detoxification of heavy metals and homeostasis of zinc and copper are some of the principal functions proposed for MTs.<br/>The principal aim of our work is to study the binding properties of isoform CuMT-II form the crab Callinectes sapidus (MTC), a crustacean MT with an atypical peptide sequence containing two cysteine triplets, which is a very unusual motif in MTs. MTC was obtained by genetic engineering protocols in zinc, copper and zinc plus copper supplemented media. The metal complexes recovered were analyzed by ESI-MS, CD, UV and ICP-AES spectroscopies. Metal coordination properties of MTC were deeper studied by means of metal reconstitution from apoMTC and by titration of ZnMTC and apoMTC with Cd(II) and Cu(I). Structural NMR studies of MTC reconstituted with 113Cd have also been carried out.<br/>MTC requires the binding of some Zn(II) ion to acquire the most chiral structure in the presence of Cu(I). Interestingly, cadmium total metallated protein shows slightly higher metal to MT stoichiometries than in the case of zinc in contrast with the equal Zn and Cd stoichiometries shown for most MTs. Moreover, NMR studies have shown that CdMTC is structured in two domains, with 3 - 4 Cd(II) ions in each of them.<br/>Additionally, we have contribute to determine the mechanism of MTs anti-inflammatory activity in brain, by studying the rule of the &#945; and &#946; domains of mammalian MT-1 in cryolesioned MTKO mice, which indicate that the &#946; domain shows better anti-inflammatory properties than the &#945; domain.