Role of MG491 protein in the motile machinery of Mycoplasma genitalium

Abstract

Mycoplasma genitalium és un patogen de transmissió sexual emergent. Aquest bacteri sense paret cel·lular causa uretritis, a més d’altres malalties inflamatòries genitals. Aquest microorganisme utilitza adhesines especialitzades i localitzades a l’organela terminal per adherir-se a cèl·lules hoste i altres superfícies. L’organela terminal, que també es troba involucrada en la motilitat cel·lular, és una estructura polar sostinguda internament per un citosquelet. Al primer capítol, s’ha dissenyat una soca mutant de M. genitalium deficient per a la proteïna MG491 que mostra una desestabilització general de les proteïnes involucrades en l’organització de l’organela terminal. Aquest mutant exhibeix sorprenents similituds amb el mutant defectiu per a la proteïna MG218, aïllat prèviament. Després de la introducció d’una còpia extra d’MG_318 a les dues soques, la quantitat d’adhesines va augmentar considerablement. Aquestes soques es van caracteritzar per microcinematografia, microscòpia de fluorescència i criomicroscòpia electrònica, revelant la presència de cèl·lules i filaments mòtils en absència de diverses proteïnes que s’havien considerat essencials per a l’adhesió i el moviment. Aquests resultats indiquen que els complexes d’adhesines juguen un paper important en la maquinària mòtil de M. genitalium i demostren que el fragment central del citosquelet no és el motor molecular que propulsa les cèl·lules de micoplasma. Aquestes soques contenen una versió minimitzada de la maquinària mòtil aportant un valuós model per investigar les característiques d’adhesió i motilitat d’aquest patogen humà. L’estructura cristal·lina de la proteïna MG491 ha sigut recentment determinada. La molècula de MG491 és un tetràmer que presenta una organització única com a dímer d’heterodímers estructurals. Aquest ordenament asimètric resulta en dos interfases molt diferents, aspecte que explica la formació de només el 50% dels ponts disulfur entre els residus Cys87 de les diferents subunitats. A més, s’ha caracteritzat in vitro la interacció entre el C-terminal de MG491 i el domini EAGR de la proteïna MG200. Al segon capítol, s’han dissenyat soques de M. genitalium amb mutacions en residus clau en l’organització de MG491. Aquestes soques mutants preserven nivells normals de totes les proteïnes de l’organela terminal, però mostren greus alteracions en la motilitat. Els resultats d’aquest treball indiquen que la proteïna MG491 està involucrada en l’estabilitat i ancoratge de l’organela terminal de M. genitalium i juga un paper important en la motilitat cel·lular. Al tercer capítol, s’ha desenvolupat un nou mètode per quantificar la capacitat d’hemadsorció de soques de micoplasma. Aquesta capacitat tradicionalment s’ha investigat determinant la capacitat d’unió d’aquestes cèl·lules a eritròcits i és un tret distintiu àmpliament examinat quan s’estudien soques de micoplasma. Tot i que els protocols per determinar qualitativament l’hemadsorció o hemaglutinació de micoplasmes són molt directes, els mètodes actuals per mesurar de forma quantitativa l’hemadsorció són cars i poc reproduïbles. Utilitzant citometria de flux, s’ha desenvolupat un procediment per quantificar ràpidament i de forma acurada l’activitat d’hemadsorció de soques de micoplasma en presència de SYBR Green I, un fluorocrom vital que tenyeix els àcids nucleics, permetent resoldre els eritròcits i els micoplasmes per mida i fluorescència. Aquest mètode és reproduïble, permet l’anàlisi cinètica de les dades obtingudes i la quantificació precisa de l’hemadsorció basada en paràmetres d’unió estàndards com la constant de dissociació Kd. Aquest procediment pot ser implementat fàcilment en un assaig estàndard per testar l’activitat d’hemadsorció del creixent número d’aïllats clínics i soques mutants de diferents espècies de micoplasma, proporcionant dades valuoses sobre la virulència d’aquests microorganismes.

Mycoplasma genitalium is an emerging human sexually transmitted pathogen. This cell-wall less bacterium causes urethritis and other genital inflammatory diseases. This microorganism uses specialized adhesins located at the terminal organelle to adhere to host cells and surfaces. The terminal organelle is a polar structure protruding from the main cell body that is internally supported by a cytoskeleton and also has an important role in cell motility. In the first chapter, we have engineered a M. genitalium null mutant for MG491 protein showing a massive downstream destabilization of proteins involved in the terminal organelle organization. This mutant strain exhibited striking similarities with the previously isolated MG_218 null mutant strain. Upon introduction of an extra copy of MG_318 in both strains, the amount of main adhesins dramatically increased. These strains were characterized by microcinematography, fluorescent microscopy and cryo-electron microcopy, revealing the presence of motile cells and filaments in the absence of many proteins previously considered essential for cell adhesion and motility. These results indicate that adhesin complexes play a major role in the motile machinery of M. genitalium and demonstrate that the rod element of the cytoskeleton core is not the molecular motor propelling mycoplasma cells. These strains containing a minimized version of the motile machinery also provide a valuable cell model to investigate the adhesion and gliding properties of this human pathogen. The crystal structure of M. genitalium MG491 protein has been recently determined. The MG491 molecule is a tetramer presenting a unique organization as a dimer of structural heterodimers. The asymmetric arrangement results in two very different intersubunit interfaces, which can explain the formation of only 50% of the disulphide bridges between Cys87 residues. Furthermore, it has been characterized the in vitro interaction between MG491 C-terminal and the EAGR domain from MG200 protein. In the second chapter, we have engineered M. genitalium cells with mutations in key residues for MG491 organization. These mutants present drastic alterations in motility, while preserving normal levels of terminal organelle proteins. The results in this work indicate that MG491 protein is involved in the stability and anchoring of the M. genitalium terminal organelle and plays a particular role in gliding motility. In the third chapter, we have developed a new method to quantify the hemadsorption activity of mycoplasma strains. Attachment activity of mycoplasma cells has been traditionally investigated by determining their hemadsorption ability to red blood cells and it is a distinctive trait widely examined when characterizing the different mycoplasma species. Despite the fact that protocols to qualitatively determine the hemadsorption or hemagglutination of mycoplasmas are straightforward, current methods when investigating hemadsorption at the quantitative level are expensive and poorly reproducible. By using flow cytometry, we have developed a procedure to quantify rapidly and accurately the hemadsorption activity of mycoplasmas in the presence of SYBR Green I, a vital fluorochrome that stains nucleic acids, allowing resolving erythrocyte and mycoplasma cells by their different size and fluorescence. This method is very reproducible and permits the kinetic analysis of the obtained data and a precise hemadsorption quantification based on standard binding parameters such as the dissociation constant Kd. The procedure we developed could be easily implemented in a standardized assay to test the hemadsorption activity of the growing number of clinical isolates and mutant strains of different mycoplasma species, providing valuable data about the virulence of these microorganisms.