Anàlisi funcional de la Kidney Androgen-regulated Protein (KAP): Interacció amb Ciclofilina B i implicacions en nefrotoxicitat provocada per Ciclosporina A

Abstract

El nostre laboratori s'ha centrat des de fa anys en l'estudi del gen que codifica per a la Kidney Androgen-regulated Protein (KAP) al ronyó murí, utilitzant-lo com a model d'estudi dels mecanismes moleculars que controlen la regulació de l'expressió gènica mitjançant andrògens al ronyó. Aquest gen, expressat de manera exclussiva per les cèl·lules epitelials del túbul proximal renal, exhibeix un control multihormonal específic en els diferents segments del mateix, amb participació d'andrògens, estrògens i hormona tiroidal. <br/> La comparació de seqüències gèniques i de la proteïna deduïda de KAP amb les dipositades en les bases de dades, no revela cap homologia amb altres gens o proteïnes conegudes. Les anàlisis de predicció de dominis funcionals tampoc suggereixen una possible localització o funció per a la KAP. Malgrat això, la relativa abundància del mRNA de la KAP, la seva localització exclussiva a l'epiteli del túbul proximal renal i l'estricte control multihormonal de la seva expressió, suggereixen que es podria tractar d'una proteïna de rellevància en fisiologia renal, i per això l'objectiu d'aquesta tesi ha estat la identificació i caracterització funcional de la proteïna KAP.<br/> La producció d'anticossos monoclonals contra dos pèptids sintètics de la KAP ens ha permès identificar la proteïna endògena per immunohistoquímica i Western blot en ronyó murí. La distribució cel·lular i control androgènic es correspon amb la del mRNA i la seva mida aparent és de 20 KDa. La proteïna també ha estat expressada i caracteritzada en sistèmes heteròlegs tals com bacteris i llevat. Assaigs de dobles híbrids en llevat ens han permès observar que la KAP interacciona de manera específica amb el receptor de CsA, la CyPB, havent-se confirmat aquesta interacció mitjançant GST-Pulldown, co-immunoprecipitació i co-localització per microscopia confocal. Malgrat els beneficis de la CsA com a immunosupressor, evitant el rebuig en pacients trasplantats, el seu ús es veu limitat pels greus efectes tòxics que produeix al ronyó, especialment a les cèl·lules del túbul proximal renal. La interacció de KAP amb CyPB ens ha portat a analitzar els efectes de la CsA sobre la interacció KAP-CyPB i sobre la expressió de la KAP. Observem que la CsA no desplaça la interacció entre KAP i CyPB. Hem demostrat que la administració de CsA a ratolins de la soca C57BL/6, disminueix de manera significativa els nivells de proteïna KAP en extractes crus de ronyó. En línies cel·lulars de túbul proximal murí, la presència de CsA augmenta la secreció de la KAP al medi de cultiu. Tanmateix, la transfecció estable de KAP i la seva sobre-expressió controlada per tetraciclina en un sistema cel·lular de túbul proximal, disminueix de forma significativa la toxicitat per CsA.

For years our laboratory has been focused on the gene that codes for the Kidney Androgen-regulated Protein (KAP) as a model to study the molecular mechanisms involved in the hormonal regulation of gene expression, mediated by androgens in mouse kidney. The KAP gene, expressed exclusively in the epithelial cells of proximal convoluted tubules, exhibits a multihormonal control of its expression in the different segments of proximal tubules, mediated by androgens, estrogens and thyroid hormone. Comparison of KAP nucleotide and amino acid sequences with sequences deposited in public databases has revealed that there is no homology with any known sequences that might indicate a possible function of the KAP protein. The relative abundance of the KAP mRNA and its exclusive localization in the epithelial cells of proximal convoluted tubules have suggested that the KAP protein might have a relevant function in kidney physiology. In this scenario, the main objective of this Thesis is the identification and functional characterization of the KAP protein.<br/> Production of monoclonal antibodies against two synthetic peptides of the KAP protein has allowed to identify the protein by Western blot and immunohistochemistry analysis in mouse kidney. The cellular distribution and androgenic control of its expression corresponds with that observed for the KAP mRNA and the protein has an apparent molecular weight of 20 kDa in SDS-PAGE gels. The protein has been also expressed and characterized in heterologous systems such as E. coli and Sacharomycces cerevisiae. By using the two-hybrid system in yeast we have been able to demonstrate that KAP interacts in a specific fashion with the Cyclosporin A (CsA) receptor, CypB. This interaction has been also proven by pulldown assays, co-immunoprecipitation and co-location using confocal microscopy.<br/> Although CsA is a potent immunosupressor, preventing the graft versus host disease in organ transplantation, its use has been limited by its deleterious side in the kidney, specially in the proximal tubule cells. The interaction between KAP and CypB pointed us to the study of the effects of CsA treatment on KAP-CyPB interaction, and on KAP expression. In our hands, CsA does not compete with KAP for CyPB interaction. We have shown that administration of CsA to C57BL/6 mice significantly diminishes the KAP protein levels in crude kidney extracts. In a cellular model, CsA treatment increases KAP secretion to the culture media. Also, stable transfection of KAP cDNA in a cellular system of proximal tubule cells has shown that overexpression of the KAP protein diminishes significantly the toxic effects of CsA in these cells.