Aproximación experimental y teórica a las carboxipeptidasas pancreáticas y reguladoras

Abstract

Las metalocarboxipeptidasas son enzimas que escinden residuos C-terminales de otras proteínas o péptidos. Dentro de esta familia de proteínas encontramos, por un lado, las procarboxipeptidasas pancreáticas y, por otro, las carboxipeptidasas reguladoras.<br/>Las procarboxipeptidasas pancreáticas son un sistema muy estudiado, del cual se cuenta con numerosos datos, tanto a nivel estructural como a nivel funcional. En esta tesis se han estudiado los mecanismos de activación e inhibición de una proteína perteneciente a este grupo, la procarboxipeptidasa B porcina. Para ello, se han obtenido mutantes de esta proteína mediante el método de expresión heteróloga de la levadura Pichia pastoris, que nos han ayudado a acabar de definir su proceso de activación, relacionándolo con algunas de sus características estructurales.<br/>En las carboxipeptidasas reguladoras se habían realizado algunos estudios funcionales, pero hasta el momento del inicio de esta tesis, eran completamente desconocidas a nivel estructural. En este trabajo se ha conseguido expresar, purificar y concentrar el dominio 2 de la carboxipeptidasa D (CPD) de pato a niveles adecuados para su cristalización y se ha resuelto su estructura cristalina. Consideramos que ésta es un prototipo para las carboxipeptidasas reguladoras, ya que es la primera estructura que se ha obtenido de esta subfamilia, y la única hasta el momento.<br/>Por último, nos hemos basado en la estructura cristalina del dominio 2 de CPD de pato para confeccionar modelos teóricos de otras reguladoras (dominios 1 y 3 de CPD de pato y CPE humana) Además, se ha resuelto la estructura del mismo dominio acomplejado con un inhibidor.<br/>La obtención de la primera estructura cristalina de una carboxipeptidasa reguladora abre las puertas para el estudio de la relación estructura/función en esta subfamilia.

Metallocarboxypeptidases are enzymes that split C-terminal residues of proteins or peptides. Whithin this protein family, we can find, on one hand, pancreatic procarboxypeptidases and, on the other hand, regulatory carboxypeptidases.<br/>Pancreatic carboxypeptidases are a very well studied system, from which we have numerous data, at the structural and at the functional level. In this thesis, activation and inhibition mechanisms of a protein from this family, porcine procarboxypeptidase B, have been studied. For this purpose, mutants of this protein have been obtained by the heterologous expression method of the yeast Pichia pastoris. This mutants helped us to define its activation process, relating it with some of its structural features.<br/>In the regulatory carboxypeptidases, some functional studies had been done. However, until the beginning of this thesis, this proteins were completely unknown at the structural level. In this work, domain 2 of duck carboxypeptidase D (CPD) has been expressed, purified and concentrated at suitable levels for its crystallization and its crystal structure was determined. We consider that this structure is a prototype for the regulatory carboxypeptidases because it is the first known structure of this subfamily and, for the moment, the unique.<br/>Based on the crystal structure of domain 2 of duck CPD, we have done theoretical models of other regulatory carboxypeptidases (domains 1 and 3 of duck CPD and human CPE) In addition, the crystal structure of the same domain complexed with an inhibitor was determined.<br/>The determination of the first crystal structure of a regulatory carboxypeptidase opens a way for the study of the relationship structure/function in this subfamily.