Estudi dels mecanismes implicats en la regulació hormonal i cèl·lula específica del gen de la Kidney Androgen-Regulated Protein (KAP), en el ronyó del ratolí

Abstract

L'expressió de la Kidney Androgen-regulated Protein (KAP) està regulada específicament y diferencialment per andrògens i hormona tiroïdal (T3) en el túbul proximal renal. Hem analitzat la transactivació del promotor del gen del KAP en cèl.lules PCT (pars convoluta) i PR (recta) derivades de ratolins transgènics L-PK/Tag1. Transfeccions transitòries amb diferents contruccions del promotor del KAP indicaven que el fragment de 224 bp era suficient per a mediar l'expressió cèl.lula específica de dit promotor. Assaigs de retardament en gel també mostraven que un putatiu element de resposta a andrògens (ARE), local.litzat a -39 bp de l'inici de transcripció, unia el receptor d'andrògens. La dihidrotestosterona (DHT) estimulava de manera androgen dependent la transactivació del KAP en cèl.lules PCT però en PR i la mutació de la putativa seqüència ARE eliminava dita activació. A més a més, l'IGF-1 però no la T3 augmentava la transactivació androgen dependent de KAP en PCT. Per tant, es suggeria que l'efecte cooperatiu de T3 en l'expressió del KAP existia in vivo podent efectar a l'activació produïda per T3 de l'hormona de creixement (GH) i al seu torn d'IGF-1. Aquests resultats demostraven l'expressió específica del curt fragment de 224 bp del promotor del KAP y suggerien interaccions sinèrgiques entre IGF-1 i andrògens en la regulació del gen del KAP en PCT.<br/>L'expressió cortical androgen dependent del KAP està afectada en hipotiroïdisme postnatal. La síntesi puntual de T3 a partir del dia 11 postnatal, comença una resposta cortical feble de KAP que va augmentant cap als dies 15-16, que és quan es produeix un pic fisiològic de T4 i el desenvolupament puberal dels ratolins. Donat que les CCAAT/Enhancer-Binding Proteins (C/EBPs) participen en respostes mitjançades per T3 i que en el promotor del KAP existeixen quatre elements de resposta consens per a C/EBPs, hem analitzat la seva participació en la resposta androgènica de KAP mitjançada per T3. La detecció de p42C/EBPa y p35C/EBPb es troba correlacionada amb l'expressió del KAP, apareixent en extractes renal nuclears de ratolins masles control i hipotiroïdals induïts amb T3 durant els dies 7-21 postnatals, però no en els hipotiroïdals no tractats. Mitjançant transfeccions transitòries es mostrava com C/EBPa i C/EBPb eren capaces d'induir respostes màximes del promotor del KAP i que la deleció de les putatives caixes d'unió a C/EBPs local.litzades a -429/-420 i -457/-448 produïa una gran disminució de l'activitat basal del promotor, irrecuperable amb la sobreexpressió de C/EBPs. Tant la depleció androgènica com al mutació de l'ARE conjuntament amb la deleció de les caixes esmentades augmentava la disminució de l'activitat basal del promotor produïda per la deleció de dites caixes. Per tant, postulem que els andrògens i la T3 mitjançant el control de C/EBPs sinergitzen en la transactivació del gen del KAP.

The kidney androgen-regulated protein (KAP) is specifically expressed and differentially regulated by androgens and triiodothyronine (T3) in proximal tubule. We have analyzed the hormonal dependent transactivation of the KAP gene promoter in PCT (pars convoluta) and PR (recta) cells derived from L-PK/Tag1 transgenic mice. Results from transient transfection studies with different KAP promoter constructs indicated that a 224 bp-truncated fragment was sufficient to mediate cell-specific expression of the KAP promoter. Gel shift assays also showed that a putative androgen-response element (ARE) located at -39 bp from the transcription initiation site was able to bind androgen receptor (AR). Dehydrotestosterone (DHT) stimulated in an androgen-dependent manner the transactivation of KAP in PCT cells but not in PR and mutation of the putative ARE sequence abolished that activation. Moreover, the IGF-1 but not T3 enhanced the androgen-dependent transactivation of KAP in PCT cells. It suggested that the cooperative effect of T3 on KAP expression existing in vivo might be effected by T3 activation of growth hormone (GH) and, in turn, of IGF-1. These results demonstrated the specific expression of a short 224 bp fragment of the KAP promoter and suggested synergistic interactions between IGF-1 and androgens for KAP gene regulation in PCT cells.<br/>The cortical androgen-dependent expression of KAP was influenced in postnatal hipothyroidism. The punctual effect of T3 in postnatal day 11 produced cortical expression of KAP gene and it was increased until days 15-16, when there is an fisiological pick of T4 and the puberal development of mice. In this point, we have analyzed the function of CCAAT/Enhancer-Binding Proteins (C/EBPs) on the enhanced androgen-dependent KAP expression by T3 because they participate in T3 responses and there are four consensous C/EBP sequences in KAP promoter. p42C/EBPa and p35C/EBPb were detected when KAP expression existed, that was in nuclear kidney extracts of euthyroid male mice and hipothyroid male mice treated with T3 from day 7 to 21 posnatal, but not in hipothyroid male mice. Transient transfections demostrated that C/EBPa and C/EBPb were able to induce the maximal KAP promoter activity achieved and the delection of putative C/EBP sequences at positions -429/-420 and -457/-448 produced an increment of the decrease observed for KAP promoter activity, that it wasn't recovered by C/EBP overexpression. Androgen deplection or ARE mutation with the deletion of mentioned C/EBP boxes decreased the basal promotor activity more than the mutation of these boxes alone. Because of these results we have postulated that the effect of androgens and T3 on KAP expression were mediated for C/EBPs.