Preparació d'antígens recombinants per a la detecció d'autoanticossos mitjançant enzimoimmunoanálisi en la síndrome de Sjögren

Abstract

La síndrome de Sjögren és una malaltia autoimmune amb una prevalença força elevada a la població general (entre el 0,5% i el 3%). Tal com succeeix en d'altres malalties d'aquesta naturalesa, la presència d'anticossos antinuclears (ANA) està àmpliament acceptada com a prova important en el seu diagnòstic. En el caso de la síndrome de Sjögren, el principal marcador serològic és la presència d'anticossos dirigits contra l'antigen SS-B (La), tot i que en alguns casos també s'ha descrit la presència única d'anticossos dirigits contra l'antigen SS-A (Ro), format per dues proteïnes (Ro60 i Ro52) associades a diferents RNA citoplasmàtics.<br/>En el treball que es presenta, es descriu el procediment d'obtenció de les proteïnes antigèniques SS-B (La) i SS-A (Ro), per tal de poder ser utilitzades posteriorment en el desenvolupament de dues enzimoimmunoanàlisis (ELISA anti-SS-B (La) i ELISA anti-SS-A (Ro)) útils per a la detecció d'anticossos dirigits contra elles. L'estrategia que es va seguir fou la següent: es van preparar tres vectors d'expressió en Escherichia coli de les tres proteïnes (SS-B, Ro60 i Ro52) mitjançant la tecnologia del DNA recombinant, es van expressar les tres proteïnes recombinants en els microorganismes procariotes en forma de proteïnes de fusió, es van purificar les proteïnes per cromatografia d'afinitat, es van immobilitzar per adsorció passiva en microplaques de poliestirè, i es van optimitzar les diferents variables dels assajos de tipus ELISA. Els dos assajos desenvolupats es van avaluar mitjançant l'estudi de les constants diagnòstiques i analítiques i l'estudi de les característiques analítiques. Per a l'ELISA anti-SS-B (La), es van obtenir els següents resultats: sensibilitat diagnòstica del 96%, especificitat diagnòstica del 97%, coeficient de repetibilitat del 2,1%, coeficient de reproductibilitat del 10,0%, i absència de reaccions creuades i interferències. Per a l'ELISA anti-SS-A (Ro) els resultats foren els següents: sensibilitat diagnòstica del 88%, especificitat diagnòstica del 91%, coeficient de repetibilitat de l'1,9%, coeficient de reproductibilitat del 10,6%, i absència de reaccions creuades i interferències.

Sjögren's syndrome is an autoimmune disease with a high prevalence (between 0.5% and 3% of population). As other autoimmune diseases, the presence of antinuclear antibodies (ANA) in sera of Sjögren's syndrome patients is widely accepted as an important evidence for its diagnostic. The main serological marker of Sjörgren's syndrome is the presence of anti-SS-B (La) antibodies, although sometimes the presence of antibodies against the antigen SS-A (Ro) has also been described. The latter antigen is composed by two proteins (Ro60 and Ro52) binded to different cytoplasmatic RNA, so that antibodies against both proteins have been described in patient's sera.<br/><br/>In that thesis, we describe the procedure for obtaining SS-B (La) and SS-A (Ro) proteins in order to be used as antigens in two enzymoimmunoassays (ELISA anti-SS-B (La) and ELISA anti-SS-A (Ro)) useful for the detection of antibodies against these proteins. We used the following strategy: first of all, three Escherichia coli expression vectors for the proteins (SS-B, Ro60 and Ro52) were constructed by means of recombinant DNA technology. The proteins were expressed in these prokaryote cells as fusion proteins, were purified by affinity cromatography and the proteins were immobilized by passive adsortion in polystyrene microplates. Finally, we optimized different variables of both ELISA and we evaluated the assays by calculating the diagnostic and analytical constants. The results obtained with the anti-SS-B (La) ELISA were the following: diagnostic sensibility 96%, diagnostic specificity 97%, intraserial CV 2.1%, interserial CV 10.0% and absence of cross-reactions and interferences. With the anti-SS-A (Ro) ELISA, the results obtained were: diagnostic sensibility 88%, diagnostic specificity 88%, intraday CV 1.9%, interday CV 10.6% and absence of cross-reactions and interferences.