Procarboxipeptidases humanes: estudis funcionals i estructurals de formes pancreàtiques i de noves formes reguladores

Abstract

L´estudi portat a terme en la tesi doctoral tracta sobre la relació estructura/funció de metalülocarboxipeptidases humanes, també anomenades carboxipeptidases (CPs). El treball realitzat s´ha dividit en dues parts diferenciades: una primera centrada en estudis funcionals i una segona part que conté estudis estructurals.<br/>Algunes CPs se sintetitzen en forma inactiva: les procarboxipeptidases (PCPs), les quals presenten segments d´activació d´una longitud de 91-96 residus, els quals han d´ésser separats del domini enzimàtic mitjançant un atac proteolític per part d´una proteasa activant. En la primera part d´aquest treball, l´optimització de sistemes d´expressió heteròloga i purificació per a la PCPA1 i PCPB humanes ha permès l´obtenció de quantitats suficients de proteïna per a realitzar un estudi detallat dels seus mecanismes d´activació. Així mateix, s´ha aplicat el mateix sistema d´expressió i purificació al mutant D255K de la PCPB humana.<br/>En contrast amb el que s´havia determinat per a la PCPA1 porcina, la PCPA1 humana presenta un mecanisme d´activació més semblant al de les formes B i A2: calen unes condicions d´activació suaus i se segueix una cinètica d´activació monotònica, en què el segment pro del proenzim no presenta activitat inhibidora sobre la carboxipeptidasa generada, essent el tall tríptic primari suficient per alliberar-lo de l´enzim.<br/>L´estudi comparatiu dels processos d´activació de la PCPB humana tipus salvatge i del seu mutant amb especificitat reversa D255K demostra la participació de la CPB en el processament del seu segment pro. D´altra banda, la generació d´una nova diana tríptica sobre Arg93A durant el procés d´activació del mutant pot indicar que la introducció de la mutació provoca una distorsió de les interaccions entre el segment pro i el domini enzimàtic.<br/>La segona part del treball es centra en estudis estructurals. D´una banda, s´ha resolt l´estructura de la PCPB humana, la qual és molt semblant a la d´altres PCPs prèviament estudiades i s´observa que la zona més variable és la regió de connexió entre el domini d´activació globular i el domini enzimàtic. Pel que fa a l´arquitectura del centre actiu, s´observen conformacions alternatives en certs residus del centre actiu. <br/>La resolució de l´estructura tridimensional de la PCPB humana, junt amb la d´altres estructures de PCPs prèviament obtingudes, ha permès l´obtenció d´un model acurat de la TAFI, un proenzim d´elevada rellevància biomèdica. L´estudi d´aquest model i l´anàlisi del seu perfil d´energia pseudopotencial permet l´elaboració d´una hipòtesi per explicar la inestabilitat conformacional intrínseca de la seva forma activa. <br/>D´altra banda, s´han modelat les estructures de tres nous membres de la família de les metalülocarboxipeptidases, els quals han estat identificats mitjançant cerques en la base de dades del genoma humà. D´acord amb la predicció de les seves especificitats els enzims s´han anomenat CPA5, CPA6 i CPO.<br/>La PCPA5 presenta major similülitud amb la PCPA1 i PCPA2 pancreàtiques. L´anàlisi de la butxaca d´especificitat indica que la l´enzim actiu mostra especificitat tipus A, amb una possible preferència per a residus C-terminals alifàtics petits.<br/>El model de la PCPA6 presenta una estructura més semblant a la PCPB, però l´especificitat predita per a l´enzim actiu és de tipus A. Les substitucions en la seva butxaca d´especificitat indiquen que la CPA6 podria presentar major eficiència en el processament de residus C-terminals hidrofòbics grans.<br/>Per a la CPO només s´ha modelat el domini enzimàtic, ja que els possibles exons codificants de la regió N-terminal no van poder ser identificats. La CPO presenta una estructura semblant a la de la CPB, però una sèrie de substitucions en la seva butxaca especificitat indiquen que presenta una nova especificitat no descrita fins ara per a residus C-terminals àcids.

This doctoral thesis focuses on the structure/function relationship of human metallocarboxypeptidases, also known as carboxypeptidases (CPs). This work has been devided into two different parts: the first part is about functional studies and the second comprises structural studies.<br/>Some CPs are synthesized as inactive precursosrs named procarboxypeptidases (PCPs), which contain long activation segments (91-96 residues) that are cleaved as a result of limited proteolysis through the action of a protease, such as trypsin. In the first part of this work, optimization of an efficient recombinant expression system and purification for human PCPA1 and PCPB allowed a detailed characterization of their tryptic activation processes.<br/>Previous detailed studies on the tryptic activation mechanism of the porcine proenzymes showed that the proteolytic processing of PCPB to a mature enzyme is a much faster process than that of PCPA1, the former following a monotonic curve and the latter a biphasic curve, as a result of the activation segment of porcine PCPA1 being a powerful competitive inhibitor of the enzyme moiety. The study reported here shows that, while human PCPB follows the general behaviour described above, this is not the case for human PCPA1 whose proteolytic processing, in terms of activation conditions, velocity of the process and shape of the activation curve, ressembles that of PCPB, as happens in the activation process of PCPA2.<br/>A reversed-specificity mutant of human PCPB, named D255K, was expressed and purified in the same manner as the wild-type form in order to study the effect of this point mutation on the tryptic activation process of PCPB. These studies demonstrate the involvement of the generated CPB in the trimming of the severed pro-segment.<br/>The second part is concerned with structural studies. On the one hand, the three-dimensional structure of human pancreatic PCPB has been solved, which is similar to previously reported PCPs structures, also in that the most variable region is the connecting segment that links both globular moieties. However, the empty active site shows subtle differences in some of the key residues for substrate binding. On the basis of this structure and others previously reported, a three-dimensional model of human TAFI, a protein of biomedical interest, has been built in order to generate a structure that may help us to understand its behaviour and also as a basis for the design of drugs to modulate its biological activity. The analysis of this model and its pseudo-potential energy profile allows us to propose an explanation for the intrinsic conformational instability of its active enzyme. <br/>On the other hand, amino acid homology searches of the human genome were performed and revealed three members of the metallocarboxypeptidase family. According to their predicted specificities these enzymes were named CPA5, CPA6 and CPO. Modelling analysis shows the overall structure of these proteins to be very similar to that of other members of the family of metallocarboxypeptidases. The active sites of CPA5 and CPA6 are predicted to cleave substrates with C-terminal hydrophobic residues, as do CPA1 and CPA2. CPO, is predicted to cleave substrates with C-terminal acidic residues, a unique activity among human CPs.