Expresión recombinante en E. Coli de antígenos de Actinobacillus Pleuropneumoniae para vacunación y diagnóstico

Abstract

Actinobacillus pleuropneumoniae es una bacteria gramnegativa que provoca la pleuroneumonía porcina. En este trabajo se ha procedido a la producción y purificación, mediante técnicas de biología molecular, de antígenos proteicos de esta bacteria y a su uso en la formulación de una vacuna por subunidades y de un ELISA para diagnóstico. Los cuatro antígenos escogidos fueron dos proteínas de membrana externa (Tbp1 y Tbp2) y dos exotoxinas (ApxI y ApxIII).<br/>La primera necesidad consistía en localizar y secuenciar el gen tbp1 en el genoma de A. pleuropneumoniae. Para la detección de tbp1 se clonó el gen tbp2, situado en posición 5' respecto del gen tbp1, y se utilizó como sonda. Tras su identificación, el gen tbp1 fue clonado en el vector pUC119 y se obtuvo su secuencia completa, ésta se depositó en el Genbank con el código de acceso Z49708, habiéndose obtenido su patente europea EP0733708 y americana 08/624655. Finalmente, el resultado de este primer apartado fue publicado (Daban et al., 1996; Medrano et al., 1997) (Anexos VII.1 y VII.2).<br/>Por otro lado, para la clonación de los genes apxIa y apxIIIa se utilizó una estrategia diferente. Al estar publicadas sus secuencias, se diseñaron cebadores de PCR en los cuales se introdujeron mutaciones que creaban dianas de restricción, permitiendo así la amplificación sobre el genoma y posterior clonación en vectores de expresión.<br/>Una vez clonados los genes codificantes para las cuatro proteínas se pasó a la producción heteróloga en Escherichia coli. Para ello se utilizaron diversos vectores: pMAL, que generan como producto de expresión una proteína de fusión con la MBP (maltose binding protein) y vectores de la gama pET, con los cuales se ha desarrollado la mayor parte del trabajo. En ellos se han clonado y producido los cuatro antígenos en diversas construcciones, tanto las proteínas completas como péptidos de las mismas. A partir de los extractos obtenidos se procedió a la purificación de los antígenos por cromatografía de afinidad aprovechando fusiones con colas de histidinas.<br/>Tras producir y purificar los cuatro antígenos (ApxI, ApxIII, Tbp1 y Tbp2) a escala de laboratorio, se procedió a la elaboración de una vacuna experimental. Se desarrollaron tres protocolos de vacunación sobre cerdos libres de anticuerpos frente a A. pleuropneumoniae. Se estudió la inocuidad y efectividad de esta vacuna.<br/>Se determinó la respuesta humoral a partir de las muestras de suero obtenidas en los ensayos de vacunación mediante técnicas de transferencia Western-blot y de ELISA indirecto. Utilizando estas muestras y otras baterías de sueros de campo de animales con historias clínicas diversas se ha desarrollado un kit de ELISA indirecto para la detección de anticuerpos frente a A. pleuropneumoniae. Los antígenos que se utilizan para la preparación de este ELISA son la Tbp2 y la ApxI producidas de forma recombinante. Este kit se comercializa actualmente bajo el nombre de CIVTEST SUISAPP.

Actinobacillus pleuropneumoniae is a gramnegative bacteria responsible for the porcine pleuropneumonia. In this work we have proceeded to the production and purification, using molecular biology techniques, of proteinaceous antigens from this bacteria and to its use in the formulation of a subunit vaccine and in an ELISA for the serological diagnostic. The four chosen antigens were two outer membrane proteins (Tbp1 y Tbp2) and two exotoxins (ApxI y ApxIII).<br/>The first requisite was the localization and sequenciation of the tbp1gene in the A. pleuropneumoniae genome. The tbp2 gene was cloned to be used as a probe for the tbp1 detection, this gene is located upstream the tbp1. After its location, the tbp1 gene was cloned in the pUC119 vector and his complete sequence was obtained, this sequence was submitted to the Genbank con el accession code Z49708, the European patent number is EP0733708 and the American is 08/624655. These results were published (Daban et al., 1996; Medrano et al., 1997) (Anexos VII.1 y VII.2).<br/>On the other side, for the ApxIa y ApxIIIa genes cloning a different strategy was employed. As their sequences were already published, PCR oligonucleotides were prepared with mutations inserted in order to generate restriction sites, allowing the amplification using the genome as template followed by cloning in expression vectors.<br/>Once the four proteins coding genes cloned we proceeded to their heterologue production in E. coli. Diverse vectors were used to achieve this: pMAL, which yields a fusion protein with the MBP (Maltose Binding Protein) and pET range vectors, most of the work has been done with the late ones. The four recombinant antigens have been cloned and produced in the pET vectors, the whole antigens and also as peptides. The recombinant proteins were purified from the expression cultures by means of affinity chromatography making use of histidine fusion tags.<br/>After the expression and purification of the four antigens (ApxI, ApxIII, Tbp1 y Tbp2) on a laboratory scale, an experimental vaccine was prepared. This vaccine was tested in three experimental protocols using pigs free form antibodies against A. pleuropneumoniae. The harmlessness and immunogenicity of this vaccine were evaluated.<br/>Western-blot and ELISA were used to make a serological titration on samples obtained from the vaccination assays. Using these samples and other field sera collections obtained from swine with known diverse clinical reports, an indirect ELISA assay kit was developed for the detection of specific antibodies against A. pleuropneumoniae. The antigens used in the preparation of the assay are the recombinant proteins Tbp2 and ApxI. This assay is currently being commercialised under the brand CIVTEST SUISAPP.