Identificació i caracterització de factors implicats en la protecció i en la regeneració del múscul esquelètic de ratolí sotmès a necrosi-regeneració crònica

Abstract

La distròfia muscular de Duchenne (DMD) és una de les malalaties recessives lligades al cromosoma X més comuns essent la seva causa primària el dèficit de distrofina, proteïna localitzada en la cara interna del sarcolema. La soca de ratolí mdx també presenta un dèficit total de distrofina i és el model animal més àmpliament utilitzat per aquesta malaltia. Malgrat el seu dèficit de distrofina, el ratolí mdx no presenta un fenotip distròfic tan sever com l'observat en la DMD humana. S'han apuntat dues hipòtesis per tractar d'explicar aquestes diferències entre la malaltia humana i el model murí. La primera atribuirïa al ratolí capacitat regenerativa més gran, mentre que la segona li atribuirïa un descens del seu ritme de necrosi a partir de cert moment de la seva vida. En aquest treball intentem clarificar aquest aspecte mitjançant diferents aproximacions: i) caracterizació morfològica de la patologia muscular durant tota la vida del ratolí mdx i estudi de marcadors de necrosi-regeneració, ii) estudi de la expressió de utrofina (proteïna que presenta elevada homologia amb la distrofina) i b-distroglicà (el lligand natural de la distrofina), iii) caracterització del paper de la proteasa uPA en la regeneració muscular, iv) el doble mutant mdx/uPA-/- com model de necrosi espontània i capacitat regenerativa disminuïda i finalment v) identificació i caracterització de noves proteïnes implicades en el procés de regeneració muscular i/o protecció enfront de la necrosi. <br/>Els resultats derivats de la caracterització morfològica apunten que el ratolí mdx no presenta necrosi durant les seves dues primers setmanes de vida, moment a partir del qual comença un increment d'aquest fenòmen arribant a un màxim al voltant dels dos mesos per a, posteriorment experimentar un descens gradual però important de l'activitat necròtica. L'anàlisi evolutiu de marcadors de necrosi-regeneració també comfirma aquesta aparició i posterior decrement de la necrosi muscular. L'estudi evolutiu de l'expressió de utrofina, ens ha permès observar com aquesta preoteïna despareix a les dues setmanes de vida, coincidint amb l'inici del descens de la necrosi muscular en els ratolins mdx, mentre que el seu posterior increment en aquests ratolins coincideix amb l'inici de la fase en que la necrosis es mostra molt més lleu. A més, els nivells de utrofina presenten una bona correlació amb els nivells b-distroglicà, comfirmant la capacitat de la utrofina per unir-se amb el que és el lligand natural de la distrofina. Aquests resultats atribueixen a la utrofina un paper com a substituta de al distrofina en el ratolí carent de distrofina.<br/>Per altre banda, el ratolí carent de uPA (uPA-/-) presenta una important reducció de la capacitat regenerativa muscular, presentant un retard temporal important en el procés regeneratiu, una acumulació de fibrina en el teixit necròtic i una disminució del reclutament de macròfags en la zona lesionada respecte els ratolins control. El tractament amb Ancrod (una toxina fibrinolítica) restaura sensiblement la seva su capacitat de regeneració. Per la seva banda, el múscul del ratolí doble mutant mdx/uPA-/- presenta un aspecte més distròfic, destacant importants acumulacions de fibres necròtiques calcificades, un augment de grups necròtics deguts a una disminució de la seva capacitat regenerativa, un pes corporal menor que les soques mdx i uPA-/- així com una mortalitat propera al 80% tot i que aquesta es concentra exclusivament en el periode de necrosi màxima. Aquests resultats confirmen la importància que té la proteasa uPA en el procés de la regeneració muscular i ens mostren com la capacitat regenerativa només només és limitant en el ratolí mdx durant el periode de màxima necrosi.<br/>Finalment, mitjançant un estudi d'expressió diferencial de gens entre ratolins controls i mdx hem pogut identificar 9 seqüències clarament sobreexpressades en ratolins mdx, essent les més interessants la tetraspanina CD63 i la seqüència anomenada B2. Experiments destinats a analitzar l'expressió d'aquestes dues seqüències ens indiquen que CD63 és també expressada en els ratolins control tot i que a nivells lleugerament inferiors que els mdx i que la seva expressió és elevada però constant durant la diferenciació de la línia mioblàstica murina C2C12 in vitro. La B2 es clarament diferencial, essent expressada per ratolins mdx i no expressada o a nivells molt baixos en controls, presentant un pic d'expressió als 3 i 6 dies de diferenciació en la línia mioblàstica murina C2C12 in vitro.

Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is one of the most common X-linked diseases. DMD is due to mutations in the DMD gene, which results in lack or dysfunction of dystrophin, a 427 KDa protein localised at the inner face of the sarcolemma. The mdx mice, the most useful animal model for DMD, carry a nonsense mutation in exon 23 of the dystrophin gene that causes lack of dystrophin. Despite some genetic, biochemical and histological similarities between DMD and mdx mice, clinical manifestations are less severe in mdx mice than humans. To explain these differences, some authors proposed that mdx mice have greater regenerative capacity than humans, thus allowing them to repair the continuous necrotic events of their skeletal muscle fibres. On the other hand, it has been suggested that a decreased necrosis in mid-age and old mdx mice may underlie the clinical differences between mdx mice and DMD patients. In this work we clarify these questions using different approximations: i) morphologic characterisation of the muscular pathology during mdx mice lifespan and study of the evolution of necrosis-regeneration markers, ii) evolutive utrophin (dystrophin high-homology protein) expression study and b-dystroglycan (the natural ligand of dystrophin), iii) characterisation of the role of urokinase type plasminogen activator (uPA) during muscular regeneration, iv) the double mutant mdx/uPA-/- as both spontaneous necrosis and impaired regeneration model and finally v) identification and characterisation of new sequences implicated in the muscular regeneration process and or in the protection against necrosis. <br/>The results obtained in the morphologic characterisation indicate that necrosis in mdx mice is scarce during first two weeks, become very active with a peak at two months and then progressively fade, remaining at very low levels. The evolutive analysis of the necrosis-regeneration markers also confirms its apparition and posterior decrement. The evolutive study of utrophin expression shows that this protein practically disappear at two weeks of age, coinciding with the onset of necrosis and its posterior increase in mdx mice is concomitant with the decrease of the muscular necrosis. Furthermore, utrophin levels show a consistent correlation with b-dystroglycan levels, confirming that utrophin is able to bind and stabilise b-dystroglycan in the sarcolemma. These results confirm a role of utrophin as a substitute of dystrophin in the mdx mice sarcolemma.<br/>The uPA deficient mice (uPA-/-) suffer an important muscular regenerative capacity reduction, showing a severe delay in the regeneration process, an abnormal fibrin accumulation in the necrotic tissue and a reduction of macrophage recruitment in the zone of injury. Ancrod treatment (fibrinolitic toxin) restores significantly its regenerative capacity. Interestingly, the double mutant mdx/uPA-/- muscle shows a more severe phenotype than mdx, with important accumulation of necrotic fibbers with calcium depositions, an increment of degenerative-regenerative groups due to the reduction of its regenerative capacity, a reductions on its corporal weight compared to mdx and uPA -/- strains and the mortality of the strain is near the 80% but concentrated exclusively in the maximal necrosis period. These results demonstrate the critical importance of uPA in the muscular regeneration process and show that, in a mdx background, the regenerative capacity is only limiting during the maximal necrosis period.<br/>Finally, using a differential expression study comparing mdx and control mice we have identified 9 sequences overexpressed in mdx mice, being the more interesting ones the tetraspanin CD63 and an unknown sequence named B2. The characterisation of its expression shows that CD63 is expressed in control mice but in the mdx mice its expression is slightly higher and that its expression is high and constant during the differentiation of the murine mioblastic line C2C12 in vitro. B2 expression is clearly differential, induced in mdx mice and not expressed or expressed at a very low levels in controls, and shows a peak of expression at days 3 and 6 days of differentiation in the murine mioblastic line C2C12 in vitro.