Clonatge i caracterització dels gens Cyp4b1, Oatp1 i Oatp-d: nous models de regulació androgènica al ronyó de ratolí

Abstract

Aquesta tesi es centra bàsicament en l'estudi i caracterització de tres gens de ratolí, que comparteixen la característica d'expressar-se a ronyó i d'estar regulats pels andrògens, els quals estimulen la seva expressió renal a nivell de mRNA.<br/>El primer d'ells correspon al gen Cyp4b1 -representant dels citocroms P450, enzims implicats en el metabolisme oxidatiu tan de substàncies endògenes com en la detoxificació de fàrmacs i xenobiòtics. S'ha estudiat la seva expressió en diversos teixits murins i, mitjançant hibridació in situ, s'ha localitzat la distribució del seus transcrits en el ronyó. En aquest darrer teixit, s'ha investigat l'efecte de les hormones andrògenes en la seva expressió, utilitzant ratolins castrats i control de vàries soques. A nivell genòmic, s'ha clonat el seu gen i les dues primeres kb de promotor del Cyp4b1, determinant la seva seqüència, la seva organització genòmica i els límits exó/intró corresponents. Amb el fragment de promotor aïllat s'han preparat construccions reporteres, amb les quals s'han realitzat assaigs de transfecció transitòria per tal d'analitzar i avaluar els possibles elements reguladors presents, tan a nivell d'expressió basal en línies renals, com a nivell d'inducció i capacitat de resposta androgènica.<br/>Els dos gens restants descrits -Oatp1 i Oatp-d/MJAM- eren prèviament desconeguts, pel que s'ha hagut de clonar i seqüenciar el seu cDNA sencer en aquest treball. Un cop identificats s'ha vist que ambdós corresponien a membres de la família murina dels transportadors d'anions orgànics, OATPs, proteïnes poliespecífiques de transport amb una ampli ventall de substrats que pot incloure des de sals biliars, esteroides conjugats i eicosanoides, fins a drogues i xenobiòtics orgànics. Al igual que pel Cyp4b1, s'ha estudiat la seva distribució tissular a nivell de missatger, i també la dependència androgènica de la seva expressió renal en diferents soques murines.<br/>Per Oatp1 en particular, s'ha realitzat una caracterització preliminar a nivell funcional determinant la seva afinitat per alguns substrats, amb assaigs de transport en oòcits de Xenopus laevis. A nivell genòmic, s'ha identificat temptativament la seqüència de la possible regió 5' adjacent del seu gen.<br/>Finalment, per Oatp-d (prèviament anomenat MJAM), s'han realitzat diversos estudis comparatius entre rosegadors i humans, que inclouen el mapatge cromosòmic del gen en ratolins i del seu corresponent ortòleg en rates. El posicionament dels gens Oatp-d de rata i OATP-D -l'ortòleg humà- en sengles regions genòmiques on han estat situats possibles loci genètics d'influència en hipertensió, ha fet que exploréssim a nivell preliminar una possible implicació d'aquest gen en els processos esmentats. S'ha abordat a través de comparar la seqüències dels cDNA corresponents i l'expressió renal de Oatp-d en rates de les soques WKY(normotenses) i SHR (hipertenses genètiques).<br/>El present treball hauria d'englobar-se dins el marc d'una aproximació als mecanismes moleculars específics reguladors de l'expressió gènica, per part dels andrògens.

This thesis is centered on the study and characterization of three murine genes with kidney androgen-regulated expression. The androgenic hormones stimulate their renal expression at the level of mRNA. <br/>The first gene corresponds to Cyp4b1, a member of cytochrome P450 family (enzymes implied in the oxidative metabolism of endogenous substances and also in detoxification of diverse drugs and xenobiotics. The expression-pattern of Cyp4b1 was analyzed in several mouse tissues and, by means of in situ hybridization, the distribution of its mRNA was located into the kidney. The effect of androgenic hormones on its renal expression was evaluated, using castrated and intact control mice of different strains. At genomic level, the organization of the Cyp4b1 structural gene was determined as well as its promoter region (about 2-kb of its proximal promoter being cloned and sequenced). With the promoter fragment isolated, it has been prepared several reporter constructs, to test the presence of putative regulatory elements in the promoter, in transient transfection experiments. The level of basal expression of those constructs in renal cell lines and the responsiveness to androgen was also evaluated. <br/>For the remaining two genes described (Oatp1 and Oatp-d/MJAM) that were previously unknown, it has been cloned and sequenced his corresponding full-length cDNAs. The both genes identified belongs to the murine organic anion transporting-polypeptide family (Oatp's), polyspecific organic anion transport proteins with broad range of substrates, which can include biliar salts, conjugated steroids and eicosanoids, organic drugs and xenobiotics. Like for the Cyp4b1, its tissue distribution at messenger level has studied, and also the androgenic dependency of its renal expression in several mouse strains. <br/>For mouse Oatp1, it has been characterized at functional level, determining his affinity for some anionic substrates in transport studies using Xenopus oocytes. At genomic level, it has been identified tentatively the 5'-flanking region of their gene.<br/>Finally, for Oatp-d (previously known as MJAM), several comparative studies between rodents and humans have been made, including the chromosomal mapping of the gene in mice and its corresponding orthologous in rats. The localization of the rat and human OATP-D genes in genomic regions where they have been described genetic loci with putative influence on hypertension, makes that we considered the analysis of the Oatp-d implication, at preliminary level, in the mentioned processes. These studies consisted in the sequencing and comparation of the corresponding cDNA full coding-regions (and also its renal expression), between Oatp-d in WKY(normotensive) and SHR (spontaneous hypertensive) rats. <br/>The present work would have to be included within the general frame of the study of molecular mechanisms of kidney androgen gene-regulation mechanisms.

Esta tesis se centra básicamente en el estudio y caracterización de tres genes murinos que comparten la característica de expresarse y estar regulados por los andrógenos en el riñón, los cuales estimulan su expresión renal a nivel de mRNA. El primero de ellos corresponde al gen Cyp4b1 -representante de los citocromos P450, enzimas implicadas en el metabolismo oxidativo tanto de sustancias endògenas como en la detoxificación de fármacos y xenobióticos. Se ha estudiado su expresión en varios tejidos murinos y, mediante hibridación in situ, localizado la distribución de sus transcritos en el riñón. En este último tejido, también se ha investigado el efecto sobre su expresión de las hormonas andrógenas, utilizando ratones castrados y control de diferentes cepas. A nivel genómico, ha sido clonado el gen del Cyp4b1 así como las dos primeras kb de promotor, determinándose su secuencia, su organización genómica y las intersecciones exón/intrón correspondientes. Con el fragmento de promotor aislado han sido preparadas diversas construcciones reporteras, con las cuales se han realizado ensayos de transfección transitoria para evaluar los posibles elementos reguladores presentes en el promotor, tanto a nivel de expresión basal en líneas renales, como a nivel de inducción y capacidad de respuesta androénica. <br/>Los dos genes restantes descritos -Oatp1 y Oatp-d/MJAM- eran previamente desconocidos, por lo cual se ha clonado y secuenciado su cDNA entero a partir de riñón. Uno vez identificados los correspondientes cDNAs, se ha visto que ambos correspondían a miembros de la familia murina de los transportadores de aniones orgánicos, OATPs, proteínas poliespecíficas de transporte con una amplio abanico de sustratos que puede incluir desde sales biliares, esteroides conjugados y eicosanoides, hasta drogas y xenobióticos orgánicos. Al igual que para el Cyp4b1, se ha estudiado su distribución tisular de ambos genes a nivel de mensajero, y también la dependencia androgénica de su expresión renal en diferentes cepas murinas. Para Oatp1 en particular, se ha caracterizado a nivel funcional de manera preliminar, determinando su afinidad por algunos sustratos mediante ensayos de transporte en oocitos de Xenopus laevis. A nivel genómico, ha sido identificada tentativamente la secuencia de la región 5' adyacente de su gen.<br/>Finalmente, por Oatp-d (previamente denominado MJAM), se han realizado varios estudios computacionales comparativos entre roedores y humanos, que incluyen el mapage cromosómico del gen en ratones y de su correspondiente ortólogo en ratas. El posicionamiento de los genes Oatp-d de rata y OATP-D -su ortólogo humano- en sendas regiones genómicas dónde se han descrito posibles loci genéticos con posible influencia sobre la hipertensión, ha hecho que exploráramos a nivel preliminar una posible implicación de este gen en los procesos mencionados. Dichos estudios se han abordado a través de la comparación de la secuencias de los cDNA correspondientes (y también su expresión renal) entre Oatp-d en ratas de las cepas WKY(normotensas) y SHR (hipertensas genéticas). <br/>El presente trabajo debería englobarse dentro del marco general de una aproximación a los mecanismos moleculares específicos reguladores de la expresión génica renal, por parte de los andrógenos.