Paper dels lípids de membrana en la capacitació i reacció acrosòmica de l'espermatozoide de boc: estudis biofísics

Abstract

La sortida de colesterol juga un paper important en la capacitació i reacció acrosòmica de l'espermatozoide. En aquesta tesi s'ha establert l'efecte de la sortida de colesterol en la "fluïdesa" de la membrana plasmàtica i en la reacció acrosòmica (RA) de l'espermatozoide de boc. <br/>La incubació dels espermatozoides en b-ciclodextrina (bCD) 8 mM com a acceptor de colesterol va donar lloc a una sortida de gairebé un 50% del colesterol de les membranes i la RA va ser induïda fins a un 35%. No obstant, quan només era eliminat el 30% de colesterol de les membranes, no s'induïa RA. Aquesta sortida de colesterol no anava acompanyada de sortida de fosfolípids, indicant que s'havia preservat la integritat de les membranes. L'esmentada sortida és molt ràpida, segueix una cinètica exponencial decreixent amb una semivida d'aproximadament 10 min, arribant al nivell asimptòtic al cap d'uns 30 min. Aquesta cinètica contrasta amb la cinètica lenta de la RA; es necessiten gairebé 2 h per assolir el màxim percentatge de RA. Es conclou que la sortida de colesterol, per sí sola, indueix RA.<br/>Es va investigar l'efecte de la sortida de colesterol en la "fluïdesa" de membrana d'espermatozoides vius i en liposomes procedents d'extractes lipídics d'espermatozoides. Utilitzant l'anisotropia de fluorescència del 1,6-difenil-1,3,5-hexatriè (DPH) es va estudiar el comportament termotròpic dels lípids de membrana, després d'1 h d'incubació dels espermatozoides en presència o absència de bCD 8 mM. Les dades experimentals es van ajustar a corbes teòriques sigmoidals, la qual cosa ens va permetre determinar acuradament els paràmetres del comportament termotròpic. En el cas dels espermatozoides sencers, es van distingir dues transicions de fase diferents, atribuïbles a diferents dominis lipídics. Així doncs, a les membranes dels espermatozoides coexisteixen regions fluïdes amb regions clarament més rígides. La sortida de colesterol va donar lloc a importants canvis en l'extensió relativa de les dues transicions de fase, indicant un increment de la fluïdesa d'alguns microdominis lipídics de la membrana dels espermatozoides i una reorganització lateral dels dominis lipídics, just abans de l'inici de la RA. <br/>Per tal d'establir quins dels macrodominis de la membrana plasmàtica de l'espermatozoide estaven implicats en la sortida de colesterol, es va utilitzar la microscòpia confocal. Mitjançant merocianina 540 com a marcador de fluïdesa, es van determinar quatre patrons de marcatge diferents en la membrana de l'espermatozoide de boc. Aquests quatre patrons tenien en comú un intens marcatge de la peça intermèdia, i es diferenciaven pel seu marcatge en el cap. Els tres patrons majoritaris es caracteritzaven per presentar o bé un marcatge en tot l'acrosoma, o bé un marcatge limitat al segment equatorial, o be un marcatge tant en el segment equatorial com en el segment apical. El patró minoritari es caracteritzava per tenir el postacrosoma més marcat. La sortida de colesterol va fer variar la freqüència d'aquests quatre patrons: va augmentar la freqüència dels patrons que presentaven un marcatge en el segment equatorial i en el segment equatorial i apical. Així doncs, la sortida de colesterol va fer augmentar la fluïdesa de la membrana plasmàtica dels espermatozoides de boc en uns macrodominis ben definits, el segment equatorial i el segment apical. La fluïdesa de la regió postacrosomal va romandre inalterada.<br/>Per tal de poder quantificar, a nivell poblacional, els canvis de fluïdesa de membrana dels espermatozoides durant la capacitació, es va utilitzar la citometria de flux. Amb aquesta tècnica es va atribuir al conjunt de la població d'espermatozoides vius un augment de la fluïdesa de membrana, induïda per la incubació en bCD 8 mM durant 1 h. Aquesta fluïdesa es va veure incrementada encara, al cap de 2 h, coincidint amb la RA massiva.

Cholesterol efflux plays an important role in sperm capacitacion and membrane fusion in the acrosome reaction (AR). In this thesis, we established the effect of cholesterol removal from goat spermatozoa on membrane "fluidity" and acrosomal responsiveness. <br/>Mature goat spermatozoa were incubated in BSA-free medium in the presence of b-cyclodextrine (bCD) as cholesterol acceptor. After incubation with 8 mM bCD, approximately 50% of cholesterol was released from sperm membranes with no loss in the phospholipid content, indicating membrane preservation, and 35% of AR was induced. However, when only 30% of cholesterol was lost, this moderate cholesterol decrease was unable to initiate AR. Cholesterol desorption was very rapid, following an exponential decay with a half-time of around 10 min, and reaching an asymptotic level at 30 min. This kinetics is in contrast with the slow sigmoidal kinetics of acrosomal responsiveness: around 2 h were required for maximal AR. Our results suggest that cholesterol efflux has a direct influence on the onset of the AR, that is, merely removing cholesterol would trigger the AR. <br/>We also investigated the effect of cholesterol removal from mature goat spermatozoa on membrane "fluidity" of live cell membranes and liposomes from sperm lipid extracts. Using steady state fluorescence anisotropy of 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH), we studied the thermotropic behavior of the membrane lipids, after incubation of live sperm for 1 h in BSA-free medium with the presence/absence of 8 mM bCD, as a cholesterol acceptor. Unimodal and bimodal theoretical sigmoids fitted best to the experimental thermotropic profiles of liposomes and whole cells, respectively. In the case of whole sperm, two transitions, attributable to different lipid domains, were clearly separated by using the fitting parameters. So, in sperm membranes fluid domains and rigid domains co-exist. After cholesterol removal, important changes in the relative extension of the two transitions were found, indicating an increase of the "fluidity" of some of the lipid microdomains of sperm membranes and a rearrangement in the lateral domain organization, just before the onset of AR.<br/>In order to establish which domains of sperm plasma membrane were implicated in cholesterol loss, we used confocal microscopy. Using merocyanine 540 as a fluidity probe, we found four staining patterns in goat sperm plasma membrane. These patterns were characterized by a strong labelling of the midpiece, and differed by their head labelling. The three most frequent patterns presented a strong labellig in all the acrosome (pattern A) or in only the equatorial region (pattern B) or in the equatorial and apical regions (pattern C). In the less frequent pattern (pattern D) the more intensely labelled region was the postacrosome. Cholesterol efflux modified the frequencies of these four patterns: an increase in the frequencies of patterns B and C at expense of patterns A and D. So, cholesterol desorption increased the fluidity of goat sperm plasma membrane in well defined macrodomains, the equatorial and apical regions. The fluidity of the postacrosomal region remained unchanged.<br/>In order to study the distribution of membrane fluidity in a goat sperm population during capacitation, we used flow cytometry. Using this technique the increase in membrane fluidity induced by 1 h of incubation on 8 mM bCD was attributed to the live sperm population. This fluidity was still increased after 2 h of incubation, just when the AR maximum percentage was reached.