Versicà, CD44 i àcid hialurònic en el melanoma humà i caní. Implicacions funcionals del complex

Abstract

En la present tesi un dels primers objectius era caracteritzar el model caní per tal d'avaluar les seves similituds amb el melanoma humà. En aquest sentit, el primer que es va descriure va ser la caracterització de tres línies de melanoma caní (CML-1, CML-6M i CML-10c2) quant a l'expressió de proteoglicans (PGs) i la seva resposta a factors de creixement. D'aquest objectiu en sortí el primer article (Am J Vet Res 2002; 63:1151-1158), on es conclou que el contingut de proteoglicans i la resposta al tractament de TGF-&#61538; de les línies de melanoma caní CML-1 i CML-6M són similars als de les línies de melanoma humà indiferenciades. En canvi, la línia cel·lular CML-10c2 produeix una baixa quantitat de proteoglicans d'elevat pes molecular. Com que aquests PGs extracel·lulars estan involucrats en el control de l'adhesió, proliferació i migració, poden jugar un important rol en la progressió dels melanomes en el gos.<br/>En veure els resultats previs de la diferencial expressió de les isoformes de versicà en les diferents línies de melanoma humà (Touab et al., 2002) i caní (Serra et al., 2002) es decidí sobreexpressar la isoforma V3 (que no conté cadenes de glicosaminoglicans) a dues línies cel·lulars de melanoma humà i dues de melanoma caní, on una era indiferenciada i expressava les isoformes V0 i V1 de versicà, i l'altra era diferenciada i no expressava cap isoforma de versicà. Es va utilitzar el sistema de transfecció retroviral per la sobreexpressió de V3 i es van fer els corresponents controls amb el vector sol. El treball es centrà en l'estudi del complex format per àcid hialurònic (HA), CD44 i versicà. La sobreexpressió de V3 reduïa marcadament el creixement cel·lular, incrementava l'adhesió i migració cel·lulars sobre HA. Aquesta migració incrementada es bloquejava quan les cèl·lules eren pre-incubades amb HA soluble o amb anticossos bloquejants de CD44, suggerint que V3 actuava alterant la interacció de l'HA amb el CD44. Per últim, es van realitzar estudis tumorigènics d'aquestes línies. Els resultats inicials mostraren que els ratolins injectats amb les cèl·lules que sobreexpressaven V3 tenien unes latències més llargues que els animals control, resultat que coincideix amb el retard del creixement observat in vitro. A més, els tumors expressaven versicà, CD44 i HA de forma diferencial entre els animals injectats amb les cèl·lules control i els injectats amb les cèl·lules. D'aquests resultats en sorgeix el segon article (acceptat sota minor revisions). Aquest segon apartat del treball es complementa amb l'estudi de l'expressió i activitat de MMPs i d'integrines en aquestes línies cel·lulars, així com de l'estudi de la migració sobre col·lagen tipus I i l'estudi del cicle cel·lular i dels seus inhibidors. <br/>Per continuar l'estudi del gos com a model del melanoma humà, el treball es va centrar en la relació existent en el complex format per versicà, HA i CD44, el principal receptor de superfície cel·lular de l'HA i sovint sobreexpressat en les cèl·lules tumorals. D'aquest objectiu en sortí el tercer article (J Comp Pathol, 2004, 130: 171-180). Per l'estudi in vitro es van utilitzar les línies cel·lulars canines CML-1 i CML-10c2. CML-1 expressa CD44, HA i versicà, cosa que permet la formació d'una matriu pericel·lular abundant, mentre que no es veu en el cas de CML-10c2, la qual expressa CD44, però produeix molt menys HA i no expressa versicà. Es van utilitzar biòpsies canines per fer l'estudi immunohistopatològic de CD44. Es va veure que la seva expressió era més intensa en els melanomes malignes, on tendia a estar present a la perfèria del tumor, mentre que era homogènia en el cas dels melanocitomes.

One of the most important aims was to characterize the canine model to evaluate its similitude with human melanoma. In this sense, the first step was to characterize the proteoglycans profile in three canine melanoma cell lines (CML-1, CML-6M and CML-10c2) and their response to growth factors. The first paper (Am J Vet Res 2002; 63:1151-1158) was originated from these results. We described that the proteoglycans content and the response to TGF-&#61538; treatment are similar between CML-1, CML-6M and undifferentiated human melanoma cell lines. In contrast, CML-10c2 cell line produce a low quantity of high molecular weight proteoglycans as the differentiated human melanoma cell lines do. These extracellular proteoglycans are involved in adhesion, proliferation and migration control, so they may have an important role in canine melanoma progression. <br/>Because of our previous results about the differential expression of versican isoforms in different human and canine melanoma cell lines (Touab et al., 2002; Serra et al., 2002; Domenzain et al., 2003) we decide to continue with the study of versican. We overexpressed V3 isoform (it has not glycosaminoglycan chains) in two human and two canine melanoma cell lines, which differ in their endogenous versican expression. Retroviral system was used and the respective controls were done with the vector only (LXSN). The work was focused on the complex formed by hyaluronic acid (HA), CD44 and versican. V3 overexpression markedly cellular growth in vitro, and it increased adhesion and migration on HA substratum. This increased migration was blocked when cells were pre-incubated with soluble HA or with blocking anti-CD44 antibody, which suggest that V3 was changing HA-CD44 interaction. Finally, we performed tumorigenic assays with the transduced cell lines. Initial results showed that mice injected intradermically with V3 cells had longer latencies than animals injected with control cells, which is similar to the observed growth rates in vitro. Furthermore, primary tumors had different expression of versican, CD44 and HA between control and V3 cells. These results are compiled in the second paper (accepted under minor revisions). This second chapter it is also complemented with the study of MMPs and integrins expression and activity, and the study of migration on type I collagen and cellular cycle as well.<br/>To continue canine study as a human model of melanoma, we focused on the relationship within the complex formed by versican, HA and CD44, the major cellular surface receptor of HA, which is often overexpressed in tumoral cells. The third paper was derived from this goal (J Comp Pathol, 2004, 130: 171-180). For in vitro studies we used CML-1 and CML-10c2 canine melanoma cell lines. CML-1 expressed CD44 and versican and produced high amounts of HA, which allowed the formation of an important pericellular coat. In contrast, we couldn't see this pericellular coat in CML-10c2 cell line, which produced little amounts of HA and didn't express versican. Canine melanocytic tumors were used to study the expression of CD44. Malignant melanomas express more CD44 than melanocytomas and the expression pattern was different between benign and malignant lesions. In malignant tumors the CD44 expression was more intense in the periphery of the tumors, whereas an homogeneous CD44 expression was showed in benign lesions.