Papel de las mutaciones del ADNmt en la producción de daño oxidativo mediado por ROS en un modelo de cíbridos transmitocondriales

Abstract

El genoma mitocondrial humano es una molécula circular de doble cadena de 16,5 kb. En su secuencia existe información para 13 polipéptidos de diferentes subunidades de los complejos de la cadena de transporte electrónico (CTE), para 22 ARNt y para 2 ARNr. Una mutación en cualquiera de estos genes puede provocar que la CTE no funcione correctamente, dando lugar a una disfunción del sistema de fosforilación oxidativa. Todo ello puede provocar por un lado un déficit de energía en las células o tejidos, o por otro lado un incremento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Según la demanda energética de cada tejido este déficit de producción de energía será más o menos importante, pudiendo incluso provocar graves trastornos fisiopatológicos.<br/>El incremento de la producción de ROS por parte de la cadena de transporte electrónico puede ser eliminado con ayuda de las defensas antioxidantes celulares. Si la producción de ROS es más importante que la acción de estas defensas, ello puede llegar a provocar lesiones en diferentes componentes celulares tales como lípidos, proteínas o al propio ADNmt. Para profundizar en este campo, en este trabajo en primer lugar se han diagnosticado a cuatro pacientes con enfermedad mitocondrial, portadores de una mutación en su genoma mitocondrial. A partir de plaquetas de estos pacientes se han generado cíbridos transmitocondriales, que se han utilizado como modelo de estudio. Se han estudiado las siguientes mutaciones en genes mitocondriales: T14487C en la subunidad ND6 del complejo I, A3243G en el ARN de transferencia Leu (UUR), A8344G en el ARN de transferencia Lys y G6930A en la subunidad COXI del complejo IV. Analizando la producción de peróxido de hidrógeno como medida de la producción de ROS en estas cuatro líneas, hemos observado que las líneas portadoras de una mutación que afectase al funcionamiento del complejo I y III (descritos ampliamente en la literatura como principales productores de ROS en la mitocondria) es decir A3243G, A8344G y T144874C, sí provocan un incremento de la producción, mientras que la mutación que no afectaba a estos complejos (G6930A) no provocaba incremento. Posteriormente se ha estudiado si este incremento producía daño oxidativo a diferentes componentes celulares, tales como lípidos, proteínas y el propio ADNmt. Previamente, debido a que en la literatura no existía un consenso claro sobre el mejor método de análisis de la peroxidación lipídica, se realizó un pequeño estudio sobre cuál era el mejor inhibidor de la peroxidación lipídica a utilizar y en que concentración, obteniendo que el mejor a utilizar era el BHT a una concentración de 3mM.<br/>En cuanto los resultados de daño oxidativo se observó que en los lípidos solo se observaba daño oxidativo en la línea portadora de la mutación T144874C, mientras que las otras no lo presentaban. En la oxidación de proteínas no se observó daño en ninguna de las cuatro líneas portadoras de la mutación y en cuanto a la oxidación del ADNmt, se observó daño oxidativo en las líneas portadoras de las mutaciones A8344G y T14487C. Con estos resultados se observa que en algunas mutaciones en el genoma mitocondrial la producción de ROS generada es superior a la capacidad detoxificadora de la célula, provocando daño oxidativo, mientras que en otras la producción de ROS no supera la acción de las enzimas antioxidantes.

Mitochondrial encephalomyopathies caused by mutations in mitochondrial DNA (mtDNA) are a heterogeneous group of disorders characterized by primary dysfunction of the oxidative phosphorylation system (OXPHOS) with a decrease in ATP production. Clinical and biochemical heterogeneity of mitochondrial disorders is due to the ubiquitous nature of mitochondria and the dual genetic (mitochondrial and nuclear DNA) control of OXPHOS. Some unique features of mitochondrial genetics, such as heteroplasmy and tissue segregation, contribute to this phenomenon. However, the precise mechanisms leading to this heterogeneity are still largely unclear.<br/>Mitochondria are the major source of reactive oxygen species (ROS), which are generated as toxic by-products of redox-coupled reactions in the electron transport chain (ETC). Inhibition of the ETC in vitro using some respiratory complex inhibitors results in a significant increase in the mitochondrial production of ROS. This increase suggests that when dysfunction of the respiratory chain complexes occurs, electrons can be transferred directly to the molecular oxygen. However, cells are well protected by antioxidant enzymes: the manganese superoxide dismutase (Mn-SOD) and copper-Zinc superoxide dismutase (CuZn-SOD) to eliminate superoxide anion (O2.-) and the glutahione peroxidase (GSH-Px) and catalase (CAT) to eliminate hydrogen peroxide. <br/>Oxidative stress results when the balance of prooxidants and antioxidants is altered in favour of the prooxidants. In turn, an excess of ROS may contribute to OXPHOS damage. Thus, to define the relationship between mtDNA mutations and production of ROS, several transmitochondrial cell lines (cybrids) carrying different mutations in their mtDNA were obtained from different mitochondrial patients. These included two common and well characterized mtDNA mutations in tRNA genes, the A3243G transition in the tRNALeu(UUR) derived from a patient with MELAS syndrome (mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes), and the A8344G mutation in the tRNALys, derived from a patient with the MERRF syndrome (myoclonus epilepsy with ragged-red fibers). In addition, another two cybrids cell lines were studied, harbouring the G6930A mutation in the gene encoding the subunit I (COI) of the cytochrome c oxidase (COX). This mutation changes the amino acid glycine into a premature termination codon, resulting in the loss of the last 170 amino acids (33%) of the polypeptide, thus causing a complete disruption in the COX assembly. The last cybrid cell line studied carried the mutation T144874C in the subunit 6 of the complex I of the ETC.<br/>Hydrogen peroxide production was increased in cybrids harbouring tRNA and complex I mutations, but no changes were observed in cybrids harbouring the mutation in complex IV. No oxidative damage to lipids, proteins or mtDNA was detected in cybrids harbouring A3243G and G6930A mutations. In the cybrid cell line harbouring A8344G mutation, only oxidative damage to mtDNA was observed and in the cybrids harbouring the mutation in complex I, mtDNA and lipid oxidative damage were detected.<br/>These results suggest that some mutations in mtDNA may increase the production of hydrogen peroxide (i.e., those mutations which affect complex I or III of the ETC) meanwhile other mutations do not. Furthermore this increase can sometimes override the antioxidant defences of the cells and produce oxidative damage to key cellular components.