Genes implicados en el desarrollo de la semilla de Arabidopsis thaliana (L.): caracterización de los genes AtAnkTm

Abstract

La embriogénesis es uno de los procesos más cruciales en el desarrollo vegetal. La secuenciación de ESTs (Expressed Sequences Tags) de la genoteca ATISLA, de semillas de 2 a 6 DDA (Días Después de Antesis), permitió identificar categorías funcionales típicas de desarrollo temprano de semilla como ciclo de división celular, reserva de nutrientes y traducción. A través del análisis in silico, considerando las ESTs de semilla inmadura depositadas en las bases de datos en una primera etapa y aquellos genes cuya expresión era elevada en semilla utilizando el programa Meta analyzer de Genevestigator en una segunda, se lograron identificar 49 genes cuya expresión es específica de semilla inmadura, resultados que fueron confirmados por RT-PCR e hibridación in situ. Al comparar estos 49 genes con el genoma completo de Arabidopsis, se encontraron diferencias estadísticas significativas para las categorías funcionales de reserva de reserva de nutrientes, metabolismo de carbohidratos, respuesta a estrés abiótico y tráfico subcelular y transporte.<br/>Las repeticiones anquirina son motivos de 33 aminoácidos repetidos en tándem cuya principal función descrita en animales es de interacción proteína-proteína. Participan en diversas funciones tanto en animales como en vegetales. Mediante análisis in silico fue posible identificar 509 repeticiones anquirina, que son codificadas por 105 genes. Se obtuvo una secuencia consenso de repetición anquirina de Arabidopsis que es similar a la de animales, por lo que es posible que las repeticiones anquirina en plantas cumplan la misma función que en animales. Los 105 genes codifican proteínas que se dividieron en 16 clases diferentes en función de los dominios o motivos que acompañaban a las repeticiones anquirina. El grupo más numeroso corresponde a las proteínas con dominios de repeticiones anquirina y transmembrana (37, proteínas ATANKTM). Mediante análisis neighbor joining de la región de dominios de repeticiones anquirina, estas proteínas se clasificaron en 6 familias distintas. Los genes AtAnkTm se encuentran repartidos en los cinco cromosomas de Arabidopsis y existen eventos de duplicación tanto a nivel inter- como intracromosómico, además de la presencia de genes duplicados en tándem (con 1 grupo de hasta 7 miembros). Mediante RT-PCR en diferentes órganos y bajo diferentes condiciones de estrés, fue posible observar que los genes AtAnkTm poseen patrones de expresión muy diferentes incluso dentro de una misma familia, por lo tanto, es posible que cumplan funciones muy variadas. Estos resultados fueron contrastados con análisis de bases de datos de ESTs y micromatrices utilizando el programa de visualización de expresión de genes de AtGenExpress. Se identificó un gen (AtAnkTm28) cuya expresión es en silicua inmadura y específicamente de semilla, mediante RT-PCR. Por hibridación in situ, se detectó expresión en embrión, suspensor y endospermo nuclear libre. La fusión de la región transmembrana de la proteína ATANKTM28 a GFP se localiza en algunos puntos específicos de la membrana citoplasmática. La mutación en los genes AtAnkTm2 y AtAnkTm9 produce una reducción en la viabilidad de los granos de polen. La mutación de AtAnktm2 también produce cambios en la estructura de la exina.

Embryogenesis is one of the most important steps in plant development. We have built a cDNA library (ATISLA) from isolated Arabidopsis seeds 2-6 DAA (Days After Anthesis) and used it for sequencing ESTs (Expressed Sequences Tags). The most abundant functional categories of the genes sequenced corresponded to cell division, nutrient reservoir and translation. We have used a two-step in silico subtraction analysis in order to identify genes specifically expressed in immature seeds. The first subtraction step was based on ESTs abundance in databases. The second subtraction step was based on microarray hybridization data obtained from the database Genevestigator. We identified 49 genes with specific expression in immature seed and we used RT-PCR and in situ hybridization analysis in order to verify the goodness of our selection method. Comparison of the functional categories of the 49 selected genes with the genes in the whole genome we identified statistically differences in some functional categories as for example nutrient reservoir, carbohydrate metabolism, abiotic stress response and sub cellular traffic and transport.<br/>Ankyrin repeats are 33-amino-acid domains that occur in tandemly arrayed sets of two or more, and are believed to function as protein-protein interaction domains. Several proteins having ankyrin repeats have been reported in animals and plants and they appear to be involved in many processes. We used in silico analysis to identify all Arabidopsis genes coding for proteins with ankyrin repeats. A total of 509 ankyrin repeats codified by 105 genes were identified. An ankyrin-repeat consensus sequence for Arabidopsis was determined, being very similar to the animal consensus, suggesting that ankyrin-repeats in plants play a similar role as in animals in protein-protein interactions. Arabidopsis ankyrin coding genes were classified in 16 groups according to the protein structures. The most abundant group contains 37 genes coding for proteins with ankyrin repeats and transmembrane domains (ATANKTM proteins). According to sequence similarity, they were classified in 6 families. The AtAnkTm genes are distributed through the five Arabidopsis chromosomes, including duplicated genes (intra- and inter- chromosomally) and groups of tandemly arrays genes. We used semi quantitative RT-PCR in order to determine the patterns of expression of these genes and we found that they were very variable, even inside a single family. These results were compared with ESTs databases and microarrays analysis using the tool Gene Expression Visualization of AtGeneExpress. One of the genes (AtAnkTm28) is expressed specifically in seeds at very early stages of development. In situ hybridization determined that this gene is expressed in the embryo proper, suspensor and free nuclear endosperm. Fusions of the transmembrane region of ATANKTM28 with GFP seem to localize at few specifics points of the plasma membrane. Mutations of two other AtAnkTm genes (AtAnkTm2 and AtAnkTm9) produce a reduction in pollen viability. Mutation in AtAnkTm2 also generates changes in the structure of the pollen surface (exin).