La inestabilidad genómica en cáncer

Abstract

La inestabilidad microsatélite (MSI) es una característica de los pacientes HNPCC. En estos tumores la perdida del sistema de reparación MMR tiene como consecuencia una acumulación progresiva de mutaciones. Hasta la actualidad no esta claro, como se acumulan estas alteraciones. Sin embargo, la MSI se puede detectar en los pacientes HNPCC antes del diagnóstico del tumor. Uno de nuestros objetivo fue evaluar la presencia de inestabilidad genética en sangre periférica de 2 familias HNPCC tanto portadores como no portadores de una mutación germinal en los genes MLH1 y MSH2. Hemos realizado un análisis extensivo de la distribución alélica de BAT26 meditante una técnica basada en PCR-clonación de esta secuencia. En los pacientes no portadores de la mutación, la distribución alelica de BAT26 sigue una distribución de campana de Gauss sin ningún alelo por debajo de 21Adeninas, mientras que todos los portadores de la mutación demuestran alelos inestables con una frecuencia de 5,6%. Por lo tanto sugerimos que la baja inestabilidad caracteriza los portadores de mutaciones en MMR. Estas observaciones sugieren que las mutaciones somáticas se acumulan antes del diagnostico del tumor, aunque no esta claro si estas acumulación de mutaciones se debe a la pérdida de MMR en un porcentaje pequeño de células o a la haploinsuficiencia del MMR. La detección de estos alelos inestables posiblemente nos puede ayudar en la identificación de portadores asintomáticos que pertenecen a familias con mutaciones germinales no detectables en MMR.<br/>Además del defecto en MMR, las alteraciones de los microsatélites en zonas no codificantes podrían tener otras causas. Por este motivo, hemos utilizado un modelo alternativo (DNA mitocondrial) para evaluar si estas alteraciones dependerán solamente del MMR como se ha postulado anteriormente. Las mutaciones somáticas en la secuencia D310 mitocondrial se ha asociado con la progresión tumoral. La inserción o la deleción de nucleótidos se ha encontrado en varios tipos de tumores. La frecuencia de mutaciones en tumores de colon, estómago u endometrio es de 23, 17 y 11%, respectivamente, que es paralelo al grado relativo de MSI observado en tumores con deficiencia en MMR (colon > estómago > endometrio, ratio relativo 10:8:4). Los tumores de colon con mutaciones de +1 nucleótido se ha observado en tumores de estadios avanzados de progresión. Se han identificado dos tumores con una mutación de T > C que restauró una repetición homoplasmica, con deleciones de secuencias de 4 y 6 nucleótidos. Estos resultados demuestran que el incremento mutacional de la secuencia repetitiva mitocondrial depende de la estructura repetitiva del DNA y no es resultado del proceso selectivo durante la tumorogénesis. Estos resultados sugieren que D310 se podría utilizar como reloj molecular para evaluar la historia replicativa de los tumores.<br/>La última parte de este estudio se concentra en el análisis de los microsatélites en zonas codificantes y el efecto que podría tener en el proceso tumorogénico. Estas alteraciones podrían cambiar el comportamiento de varias vías donde están implicados estos genes.<br/>El mantenimiento de la estabilidad genómica depende de una respuesta celular apropiada al daño y la integridad del sistema de reparación del DNA. Hemos analizado varios genes diana implicados en estas 2 vías en tumores con MSI. Hemos encontrado una alta frecuencia de mutaciones en los genes ATR (21%), MED1 (43%), hMSH3 (56%) y hMSH6 (43%). También se ha detectado una baja frecuencia en CHK1 (9% de los tumores). Estos resultados confirman que ATR, MED1 y CHK1 son genes diana en el proceso tumoral de estómago, y también sugiere que MED1 junto con hMSH3 y hMSH6 aumentan la inestabilidad genómica considerándolos como mutadores segundarios. Además, estos resultados sugieren la inhibición de la vía de respuesta de daño genómico que depende de ATR y CHK1 y que probablemente está implicada en el proceso tumoral en tumores gástricos con MSI.

Microsatellite instability (MSI) characterizes tumors arising in patients with HNPCC syndrome. In these tumors, the loss of MMR compromises the genome integrity, allowing the progressive accumulation of mutations and the establishment of a mutator phenotype in a recessive manner. It is not clear, however, whether MSI can be detected in HNPCC carriers before tumor diagnosis. The aim of this study was to evaluate the presence of genetic instability in MMR gene carriers in peripheral blood lymphocytes of carriers and non-carriers members of two HNPCC families harboring a germline MLH1 and MSH2 mutation, respectively. An extensive analysis of the allelic distribution of single molecules of the polyA tract bat26 was performed using a highly sensitive PCR-cloning approach. In non-carriers, the allelic distribution of single bat26 molecules followed a gaussian distribution with no bat26 alleles shorter than (A)21. All mutation carriers showed unstable alleles with an overall frequency of 5.6%. We therefore suggest that low levels of genomic instability characterize MMR mutation carriers. These observations suggest that somatic mutations accumulate well before tumor diagnosis. Even though it is not clear whether this is due to the presence of a small percentage of cells with lost MMR or due to MMR haploinsufficiency, detection of these short unstable alleles might help in the identification of asymptomatic carriers belonging to families with no detectable MMR gene mutations.<br/>In addition to the defect in MMR, alterations of microsatellites in no- coding regions may have other causes. For this reason we have used an alternative model (mitocondrial DNA) to evaluate if these alterations depend only on the defects of the MMR, as previously thought. Somatic mutations at a mitochondrial noncoding polycytidine D310 repeat have been associated with tumor progression. We analyzed whether these alterations are due to the inherent mutability of repeated sequences. Insertion and deletion mutations were found in colon, stomach, endometrium, breast, lung, and prostate tumors. The mutation frequency in colon, gastric, and endometrial tumors was 23, 17, and 11% respectively, which paralleled the relative extent of microsatellite instability in long mononucleotide repeats observed in tumors with mismatch repair deficiency (colon > stomach > endometrium, relative ratio 10:8:4). Colon tumors with mutations of more than one nucleotide were more advanced in tumor progression. Further, two tumors showing a T > C mutation that restored the homopolymeric repeat, harbored sequential deletion mutations of 4 and 6 nucleotides. These results illustrate that the increased mutability of repeated mitochondrial sequences is dependent on the repetitive structure of the DNA molecule and suggest that mutations in the D310, whether homoplasmic or not, and by extrapolation, mitochondrial mutations in general, are not the result of selective pressure during tumorigenesis. We also suggest that the D310 may be used as an universal molecular clock to estimate the relative mitotic history of tumors.<br/>The last part of this thesis concentrates in studying the alterations of microsatellites in coding regions and the effect that these will have in tumorogenesis process. Alteration in these genes sequences may be change the behaviour comportment of several pathways.. <br/>Maintenance of genomic stability depends on the appropriate cellular responses to DNA damage and the integrity of the DNA repair systems. We analyzed stomach tumors with MSI for frameshift mutations in several potential targets of the mutator phenotype involved in DNA damage-response pathways, and DNA repair system. High frequency of mutations was found within ATR (21%), MED1 (43%), hMSH3 (56%) and hMSH6 (43%) genes. Also, a low frequency of mutations within the CHK1 gene was detected in 9% of tumors. These results confirm ATR, MED1 and CHK1 as targets of the mutator pathway in stomach tumorigenesis, and also suggest a potential role of MED1 increasing, together with hMSH3 and hMSH6, the genomic instability in the mutator pathway as a secondary mutator. Furthermore, these results suggest that the inhibition of the ATR-CHK1 DNA damage-response pathway might be involved in the tumorigenesis of gastric cancer with MSI.