Estudio sobre la expresión y localización de la guanilil ciclasa sensible a NO (GCNO) en células nerviosas

Abstract

La guanilil ciclasa sensible a NO (GCNO) cataliza la formación de GMPc y es la principal diana del NO en el SNC. La GCNO es un heterodímero compuesto por una subunidad &#945; y una &#946;. Dos isoformas de cada subunidad han sido clonadas. En esta tesis estudiamos la distribución anatómica de los mRNAs de las subunidades en cerebro de rata y mono. Nuestros resultados revelan que en ambas especies el mRNA de la &#946;1 es más abundante y ubicuo en cerebro. El mRNA de la subunidad &#946;2 no pudo ser detectado en ninguna de las dos especies. La distribución de las subunidades &#945; presentó similitudes en el sistema límbico y en caudado-putamen de ambas especies y diferencias en la distribución laminar en corteza. Mientras que en rata la subunidad &#945;1 es elevada en capas externas corticales, en mono lo es en las capas internas. Además, el mRNA de &#945;1 es más ubicuo en el mono y el mRNA de la &#945;2 en la rata.<br/>Una elevada expresión de las tres subunidades se observó en ganglios basales, sistema olfatorio, hipocampo y corteza. También encontramos regiones donde la expresión de la subunidad &#946;1 era alta y pero la expresión de ambas &#945; era baja o indetectable. En la rata, esto ocurre en las islas de Calleja, la mayoría de los núcleos talámicos y el colículo superior, y en mono ocurre en los núcleos talámicos y en el claustrum. El sistema NO-GMPc ha sido implicado en plasticidad sináptica, procesamiento sensorial y comportamiento en la rata, los niveles elevados de las tres subunidades en regiones como los ganglios basales, hipocampo y cerebelo en mono sugieren que en primates también estaría involucrado en estos procesos.<br/>Estudios previos demostraban que agentes inflamatorios disminuían la actividad GCNO como consecuencia de la disminución de la subunidad &#946;1 en astrocitos en cultivo y en cerebro de ratas adultas. En este trabajo estudiamos si la actividad GCNO también estaba alterada en cerebro de pacientes con enfermedades neurodegenerativas con un componente inflamatorio como Alzheimer (AD), Creytzfeldt-Jakob (CJ) y esclerosis múltiple (MS). Los resultados demuestran que no existen diferencias significativas entre los individuos control y los enfermos AD con distinto grado de afectación en la actividad basal GCNO o estimulada con donadores de NO, ni en los niveles de expresión de las subunidades &#946;1 y &#945;1. Mediante inmunocitoquímica demostramos que las neuronas y en astrocitos de sustancia blanca presentan un nivel de expresión elevado para la &#946;1. En pacientes AD, los niveles de expresión no estan alterados en neuronas y astrocitos fibrilares mientras que se detectó disminución de &#946;1 en astrocitos reactivos alrededor de las placas amiloides. El marcaje se ve también disminuido en astrocitos reactivos de sustancia blanca de pacientes con CJ y MS. Así, la inducción de la reactividad glial está asociada a una disminución en la capacidad de generar GMPc en respuesta a NO. <br/>Estudios previos demostraban que la disminución de la subunidad &#946;1 inducida por LPS era dependiente de transcripción y síntesis de proteínas, pero independiente de NO. En esta tesis estudiamos el mecanismo involucrado en la degradación de esta subunidad, siendo la vía que involucra al proteosoma y la ubiquitina responsable de la disminución. También, demostramos que el tratamiento con LPS produce la formación de agregados de &#946;1 en el núcleo, en estructuras ricas en proteosoma 20S y ubiquitina con características de clastosomas. La formación de estos agregados es inhibida por inhibidores específicos del proteosoma y de la síntesis de proteínas. <br/>Durante estos estudios observamos la presencia de &#946;1 en células con actividad GCNO (neuronas y astrocitos), así como en células sin actividad GCNO (microglía). En ambos casos la localización era mayoritariamente citosólica pero también aparecía en el núcleo. La intensidad de marcaje aumentaba en células en división. A mayor aumento observamos que &#946;1 se encontraba asociada periféricamente a los cromosomas durante todas las fases de la mitosis. Debido a la localización pericromosomal, nos propusimos estudiar si la &#946;1 ejercía alguna función sobre la condensación de la cromatina. Mediante un ensayo de condensación in vitro demostramos que la inmunodepleción de la proteína nuclear y citoplasmática provocaba aumento en la condensación. También demostramos que el silenciamiento de &#946;1 por siRNA producía un aumento del número de células que ingresaban en el ciclo celular y un aumento de la proliferación. Todos estos efectos fueron independientes de la actividad enzimática ya que un inhibidor especifico de la GCNO no mimetizaba los efectos del siRNA ni de la inmunodepleción. Estos resultados nos llevan a proponer que la subunidad &#946;1 de la GCNO podría tener una función independiente de su actividad enzimática.

Nitric oxide (NO) exerts most of its physiological effects through activation of a predominantly soluble guanylyl cyclase (sGC). In mammalian cells sGC exists as a heterodimer of &#945; and &#946; subunits. Currently, four subunits (&#945;1-2 and &#946;1-2) have been characterized. We used in situ hybridization with subunit-specific 33P-labeled oligonucleotide probes to compare the anatomical distribution of sGC subunit mRNAs in rat and monkey brains. Message for all subunits except &#946;2 was detected in both species. The sGC subunit showing the highest expression and widest distribution was &#946;1. High expression for all subunits was found in basal ganglia, olfactory system, hippocampus, cortex, and cerebellum. Minor species differences<br/>in the relative distribution of &#945; subunits were observed. In general, the &#945;1 message was more prominent in monkey brain and the &#945;2 message in rat brain. This was more evident in limbic areas and cerebellar cortex. Some differences were also observed in subunit laminar distribution in cerebral cortex. The limited species differences in sGC subunit distribution suggest that in primates, as occurs in rodents, the NO-cGMP signaling pathway will be involved in important brain functions such as memory formation, sensory processing, and behavior.<br/>In Alzheimer's disease (AD) brains increased NO synthase (NOS) expression is found in reactive astrocytes surrounding amyloid plaques. We have recently shown that treatment with &#946;-amyloid peptides or IL-1B down-regulates GCNO in cultured astrocytes and in adult rat brain. In this work, we have examined GCNO activity and expression in postmortem brain tissue of AD patients and matched controls. No significant alteration was observed in basal or NO-stimulated GCNO activity, nor in GCNO &#946;1 and &#945;1 subunit levels in cortical extracts of AD brains. Immunohistochemistry showed intense and widespread labeling of GCNO &#946;1 in cortical and hippocampal neurons and white matter fibrillar astrocytes, while grey matter astrocytes were faintly stained. In AD, expression of GCNO in neurons and fibrillar astrocytes is not altered but is markedly reduced in reactive astrocytes surrounding amyloid plaques. Immunostaining for GCNO &#946;1 was also lacking in reactive astrocytes in cortex and subcortical white matter in Creutzfeldt-Jakob disease brains and in subacute and chronic plaques in multiple sclerosis (MS) brains. Thus, induction of astrocytes reactivity is associated with decreased capacity to generate cGMP in response to NO both in vitro and in vivo. This effect may be related to the development of the astroglial inflammatory response<br/>We previously showed that treatment with bacterial cell wall lipopolysaccharide (LPS) or proinflammatory cytokines decreases GCNO activity in astrocytes by decreasing the half-life of the obligate GCNO &#946;1 subunit in a NO-independent but transcription- and translation-dependent process. Here we show that LPS-induced &#946;1 degradation requires proteasome activity and is independent of NF&#954;B activation or inhibition of &#946;1 interaction with HSP90. Immunocytochemistry and confocal microscopy revealed that LPS promotes co-localization of the predominantly soluble &#946;1 protein with ubiquitin and the 20S proteasome in nuclear aggregates that present characteristics of clastosomes, nucleoplasmic substructures involved in ubiquitin-proteasome-dependent nuclear proteolysis. Proteasome and protein synthesis inhibitors prevented LPS-induced clastosome assembly and nuclear colocalization of &#946;1 with ubiquitin and 20S proteasome strongly supporting a role for these transient nuclear structures in GCNO down-regulation during neuroinflammation.<br/>Functional GCNO exists as &#945;1/&#946;1 and &#945;2/&#946;1 heterodimers and is predominantly cytosolic, although recent studies indicate that it can associate to membranes and other intracellular structures including nuclei. In the CNS, in situ hybridization studies evidenced that &#946;1 is more widespread than &#945; subunits and that in some areas is almost the only GCNO subunit expressed, suggesting that it may have functions other than GCNO activity. In the course of our studies on the cellular and sub-cellular distribution of GCNO in rat CNS glial cells we found that the &#946;1 subunit is localized in the cytoplasm and the nucleus of cells expressing &#945; subunits and GCNO activity (astrocytes, C6 glioma), as well as in cells devoid of &#945; subunits and GCNO activity (microglia). In both cell types &#946;1 associates peripherally to chromosomes during all phases of mitosis. In C6 cells, immunodepletion of &#946;1 enhances chromatin condensation in an in vitro assay. Moreover, silencing &#946;1 by siRNA increases the percentage of cells that enter the cell cycle and the proliferation rate. These actions are not mimicked by treatment with a specific GCNO inhibitor (ODQ). We postulate that the &#946;1 subunit is a multifunctional protein that, in addition to its role as an obligate monomer in active GCNO, associates to chromosomes during mitosis and regulates chromatin condensation and cell cycle progression.