Estudio de los mecanismos moleculares implicados en la muerte apoptótica en un modelo de isquemia cerebral in vitro

Abstract

La isquemia cerebral es la tercera causa de muerte en los países industrializados y constituye la principal causa de discapacidad en el adulto. A pesar de la enorme importancia socio-económica de esta enfermedad, hasta ahora el único tratamiento aprobado para paliarla es la administración del activador tisular del plasminógeno (tPA), el cual sólo se puede aplicar a un 5% de los pacientes. Por eso, es de vital importancia seguir realizando estudios destinados a profundizar en el conocimiento del los mecanismos moleculares implicados en esta patología. En los últimos años han aparecido evidencias que apoyan la idea de que en la isquemia cerebral, además de ocurrir una muerte celular necrótica, también se está produciendo una muerte más lenta de tipo apoptótico. Al tratarse la apoptosis de un proceso regulado y que requiere más tiempo para su ejecución, la ventana terapéutica que ofrece es mucho mayor. Tomando como base estas observaciones, el presente trabajo se ha centrado en el estudio de los mecanismos moleculares que subyacen a la isquemia cerebral. Para ello, se utilizó principalmente el modelo de privación de oxígeno y glucosa (OGD) en cultivos celulares mixtos de corteza cerebral de rata. <br/>La primera parte de este trabajo se ha centrado en estudiar el papel del factor de necrosis tumoral alfa (TNF&#945;) en la OGD. Se observó que la OGD provoca una liberación de TNF&#945; que, a través del receptor TNFR1, activa la caspasa-8, la cual es responsable de activar posteriormente la caspasa-3, una proteasa clave en la ejecución de la apoptosis. Además, se observó que inhibiendo el efecto del TNF&#945; liberado o de la caspasa-8, se reduce la muerte inducida por la OGD. Estos datos sugieren que la caspasa-8 tiene un papel clave como caspasa iniciadora de la cascada apoptótica en respuesta a la liberación de TNF&#945; mediada por la OGD.<br/>Por otro lado, se ha estudiado el papel del estrés del retículo endoplasmático (RE) en la OGD y en la hipoxia-isquemia neonatal. En ambos modelos se observó una activación de las vías de IRE1 y PERK, además de la proteólisis de la caspasa-12. Los resultados obtenidos indican también que la activación de esta caspasa en la OGD viene mediada por la calpaína y se debe a la entrada masiva de calcio mediada por los receptores de NMDA, sugiriendo que esta activación puede ser independiente del estrés del RE.<br/>Finalmente, se ha realizado un análisis masivo de los cambios de la expresión génica inducidos por la OGD, mediante la técnica de microarray. Entre los genes cuyo incremento se detectaba en el microarray, se confirmó el incremento de expresión de varios factores de transcripción que pueden tener un papel clave en la isquemia cerebral, como atf3, egr1, cebp&#948;, nr4a1 y nr4a3. Además, este estudio ha permitido caracterizar los principales clusters de genes inducidos en la OGD, observándose que muchos de los genes cuyo incremento se había observado en modelos murinos de isquemia cerebral, también se encontraban incrementados en la OGD. Estos resultados ponen de relieve que el modelo de OGD en cultivos mixtos de células corticales es una buena aproximación para el estudio de la isquemia cerebral. Por lo tanto, los resultados obtenidos en los apartados anteriores, los cuales aportan nuevos datos sobre mecanismos moleculares en la OGD, pueden servir de base para su extrapolación a los mecanismos moleculares implicados en la isquemia y por tanto, para diseñar nuevas y mejores herramientas terapéuticas, con el fin de paliar esta enfermedad.

Brain ischemia is the third cause of death in industrialized countries and the main reason of adulthood incapacity. Although the great social-economic importance of this disease, the only approved treatment, until now, is the tissue plasminogen activator (tPA). That's why is really important to continue with studies focused in extending the knowledge of the molecular mechanisms involved in this pathology. In the last years mounting evidences supporting the idea that in brain ischemia both necrotic and apoptotic cell death are taking place, had appeared. Since apoptosis is a well regulated process and it takes more time, it offers longer therapeutic window. Taken in account these observations, the present work has been focused in the study of molecular mechanisms underlying brain ischemia. For this purpose, the oxygen and glucose deprivation (OGD) model in mixed cortical cells culture was used.<br/>The first part of this work was focused in studying the role of tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) in OGD. It was shown that OGD evokes TNF&#945; release, and this cytokine activates caspasa-8 through TNFR1 receptor. This initiator caspase is responsible of subsequent activation of caspase-3, a key protease in apoptosis execution. Moreover, it was shown that inhibition of TNF&#945; or caspase-8 effect reduces the OGD-induced cell death. These data suggest that caspase-8 has a key role as initiator of apoptotic cascade in response to released TNF&#945; in OGD. <br/>On the other hand, the role of endoplasmatic reticulum (ER) stress was studied in OGD and neonatal hypoxia-ischemia. In both models was shown the activation of IRE1 and PERK pathways, as well as the caspase-12 proteolysis. The obtained results also indicate that the activation of this caspase is mediated by calpain and it is due to the massive entrance of calcium regulated by NMDA receptors, suggesting that this activation is independent of ER stress.<br/>Finally, a massive analysis of genetic expression changes induced by OGD was performed using microarray technology. Among the increased genes detected by microarray, it was confirmed the increase of expression of several transcription factor whose could have a key role in brain ischemia, as atf3, egr1, cebp&#948;, nr4a1 y nr4a3. Moreover, this study has allowed the characterization of main gene clusters induced by OGD, showing that many of increased genes in murine models of brain ischemia were also increased in OGD. These results demonstrate that the OGD model in mixed cortical cells cultures is an adequate approximation for the study of brain ischemia. So, the obtained results in this work could serve as the basis for extrapolation to the molecular mechanisms involved in brain ischemia, and hence, for designing new and better therapeutic tools.