Caracterització cinètica de la formació de fibres amiloides i cerca de funcions remotes de dominis d'activació de procarboxipeptidases humanes

Abstract

Els dominis d'activació són presents en la porció N-terminal de la forma inactiva de les procarboxipeptidases de la subfamília de proteases M14A, i les seves funcions descrites comprenen tant el manteniment d'aquest estat inactiu com l'assistència en el plegament de l'enzim complet. La limitada mida i la notable estabilitat derivada de la gran quantitat d'estructura secundària han fet que un d'aquests dominis, el de la procarboxipeptidasa A2 humana (ADA2h) hagi estat un bon model per a l'estudi del plegament proteic, en treballs anteriors, i de l'agregació en forma de fibres amiloides en la present tesi. Els estudis cinètics de dicroisme circular de la variant salvatge i una extensa bateria de mutants puntuals revelen la seqüència corresponent a la cadena beta-4 com la responsable de la direcció del procés d'agregació ordenada en conformació beta. Mutacions en aquesta zona tenen la capacitat tant d'accelerar dramàticament la velocitat d'agregació, com d'abolir-la totalment. Les correlacions amb algorismes predictius de l'agregació basats en les propietats físico-químiques de la seqüència polipeptídica posen de manifest la rellevància principal de l'estructura primària en el govern del procés. La cinètica d'agregació per dicroisme circular mostra una naturalesa dual, amb una segona etapa pràcticament independent de concentració proteica, indicant una etapa tardana de reorganització conformacional. Estudis cinètics complementaris per espectroscòpia d'infraroig mostren igualment una reorganització molecular i assenyalen que la conformació agregada en beta present a la fibra amiloide sembla originar-se primerament a partir de les hèlixs-alfa parcialment desplegades. L'estudi de mutants amb diferent propensió a l'agregació i estabilitat ha mostrat que les mutacions comporten canvis en la via d'agregació, però que finalment arriben al mateix punt de fibril·lació.<br/>Una possible funció alternativa per a un d'aquests dominis, els quals tenen una extraordinària complexitat en comparació amb altres seqüències inhibidores en cis, ha estat cercada mitjançant eines bioinformàtiques. Certa similitud seqüencial i estructural sembla ser trobada entre el domini d'activació de la procarboxipeptidasa A4 humana (ADA4h) i un domini d'unió a RNA (RRM), suggerint una possible funció ancestral per al primer, bé que no tots els residus claus per a la interacció són presents a ADA4h. La hipòtesi ha estat comprovada experimentalment mitjançant un gel de retardament, observant-se una unió a RNA dèbil i inespecífica per al RNA assajat, d'acord amb el que s'havia predit bioinformàticament. Aquest fet no exclou, emperò, una unió fisiològica i específica amb un altra molècula de RNA diferent a l'assajada.

Los dominios de activación están presentes en la porción N-terminal de la forma inactiva de las procarboxipeptidasas de la subfamilia de proteasas M14A, y sus funciones descritas comprenden tanto el mantenimiento de este estado inactivo como la asistencia en el plegamiento de la enzima completa. Su limitada longitud y notable estabilidad, derivada de la gran cantidad de estructura secundaria, han hecho que uno de estos dominios, el de la procarboxipeptidasa A2 humana (ADA2h) haya sido un buen modelo para el estudio del plegamiento proteico, en trabajos anteriores, y de la agregación en forma de fibras amiloides en la presente tesis. Los estudios cinéticos de dicroísmo circular de la variante salvaje y una extensa batería de mutantes puntuales revelan la secuencia correspondiente a la cadena beta-4 como la responsable de la dirección del proceso de agregación ordenada en conformación beta. Mutaciones en esta zona tienen la capacidad tanto de acelerar dramáticamente la velocidad de agregación, como de abolirla totalmente. Las correlaciones con algoritmos predictivos de agregación basados en las propiedades fisicoquímicas de la secuencia polipeptídica ponen de manifiesto la relevancia principal de la estructura primaria en el gobierno del proceso. La cinética de agregación por dicroísmo circular muestra una naturaleza dual, con una segunda etapa prácticamente independiente de concentración proteica, indicando una etapa tardía de reorganización conformacional. Estudios cinéticos complementarios por espectroscopia de infrarrojo muestran igualmente una reorganización molecular y señalan que la conformación agregada en beta presente en la fibra amiloide parece originarse primeramente a partir de las hélices alfa parcialmente desplegadas. El estudio de mutantes con diferente propensión de agregación y estabilidad ha demostrado que las mutaciones producen cambios en la vía de agregación, pero que finalmente convergen en el mismo punto de fibrilación.<br/>Una posible función alternativa para uno de estos dominios, las cuales tienen una extraordinaria complejidad en comparación con otras secuencias inhibidoras en cis, ha sido buscada mediante herramientas bioinformáticas. Cierta similitud secuencial y estructural parece haber sido encontrada entre el dominio de activación de la procarboxipeptidasa A4 humana (ADA4h) y un dominio de unión a RNA (RRM), sugiriendo una posible función ancestral para el primero, aunque no todos los residuos clave para la interacción son presentes en ADA4h. La hipótesis ha sido comprobada experimentalmente mediante un gel de retardo, observándose una unión a RNA débil e inespecífica para el RNA ensayado, de acuerdo con lo que había sido predicho bioinformáticamente. Este hecho no excluiría una unión fisiológica y específica con otra molécula de RNA diferente a la ensayada.

The activation domains are found in the N-terminal portion of the inactive form of the M14A subfamily procarboxypeptidases, and their described functions comprise the maintenance of the inactive state and the folding assistance of the proenzyme. Their limited size and notable stability, derived from the high amount of secondary structure, promoted the use of one of these domains, the activation domain of procarboxypeptidase A2 (ADA2h), as a folding model, in previous works, and as an amyloid formation model in the present thesis. The kinetic experiments of aggregation on the wild-type protein and a big battery of point mutants indicate that the sequence corresponding to beta-strand 4 is the main responsible of the direction of the ordered aggregation process. Mutations in this zone can either accelerate or decelerate the velocity of the aggregation process, and even abolish aggregation completely. The correlations with prediction algorithms based on the physicochemical properties of the polypeptide sequence show the relevance of the primary structure in the lead of the process. The kinetics of aggregation followed by circular dichroism exhibit a dual nature, with a second phase almost independent of protein concentration, thus indicating a late phase of conformational reorganisation. Complementary kinetic studies on ADA2h followed by infrared spectroscopy also reveal a molecular reorganisation phase, and identify the partially exposed alpha-helices as the origin of the aggregated conformation. These experiments were carried out with 3 other point mutants with different stability and aggregation velocities (according to the previous experiments), and proved that the mutations introduce changes in the aggregation pathway although the same final point is reached for all of them.<br/>A possible alternative function for one of these domains, which have an extraordinary complexity compared to other inhibitory sequences found in cis, has been investigated using bioinformatic tools. Some sequential and structural similarity has been found between the activation domain of procarboxypeptidase A4 (ADA4h) and a RNA binding domain (RRM), thus suggesting a possible ancestral function for the activation domain. However, not all the key residues required for an interaction with RNA can be found in ADA4h, hence a weaker interaction was predicted. This hypothesis has been experimentally tested using electrophoretic mobility shift assays (EMSA), observing a weak and unspecific RNA binding. It remains to be tested, however, if a physiological (and therefore specific) binding could be carried out for ADA4h using a different RNA molecule from the one assayed.