Optimació de formulacions amb fosfolípids per a ús dermatològic

Abstract

El treball descriu, principalment, la preparació de suspensions de liposomes (L) amb diferents fàrmacs encapsulats (ditranol: DT; hidrocortisona: HC; i butirat-propionat d'hidrocortisona:HBP) així com la d'emulsions o/w amb oli de borratja (OB/aigua) estabilitzades amb fosfolípids (F). Aquestes formulacions tenen interès dermatològic, i els mètodes de preparació emprats són directament escalables a la indústria. Prèviament a l'encapsulació dels fàrmacs en liposomes i a la preparació de les emulsions va ser necessari fer els següents estudis: <br/>1.- L'efecte de la concentració de F, del diàmetre dels liposomes i de la concentració de sacarosa, en la liofilització de les vesícules. Els resultats mostren que únicament els liposomes petits (&#8804;100 nm) presentaren molt baixa estabilitat física durant la liofilització, augmentant notablement el seu diàmetre un cop rehidratats.<br/>2.- L'estabilitat dels L en hidrogels obtinguts amb Carbopol 940. Es va comprovar que tots els L estudiats van ser estables en els esmentats hidrogels.<br/>3.- La determinació de les condicions d'anàlisi de la grandària de les vesícules mitjançant detecció heterodina de l'espectre de freqüències de la llum dispersada. L'instrument emprat va ser el Microtrac UPA 150 (UPA). Pel que fa a aquesta tècnica, es comprovà que les anàlisis de les grandàries amb l'UPA 150 han de complir les següents condicions:<br/>a) un temps de lectura &#8805; 10 minuts; <br/>b) un índex de càrrega situat entre 0,1 i 1; <br/>c) la necessitat de treballar dins l'interval lineal de la relació concentració de les mostres-índex de càrrega; <br/>d) la fracció en volum de la fase contínua ha d'ésser &#8805; 0,97; <br/>e) cal realitzar un apantallament de les càrregues elèctriques que puguin tenir les vesícules. En cas contrari, es produeixen alteracions de la seva distribució de velocitats, causant anàlisis incorrectes.<br/>4.- La posta a punt de l'obtenció de vesícules amb un homogeneïtzador d'alta pressió escalable a nivell industrial, el Microfluidizer 110S (M110S). Els resultats mostren que el control dels cicles de processament, la pressió de treball, la força iònica del medi aquós de la suspensió, la concentració d'etanol (en cas de formar part de la formulació) i la concentració de F, permeten determinar amb precisió les característiques de la població de L obtinguts amb el M110S. El diàmetre, la dispersió de la població, i el volum encapsulat de les vesícules s'ajusten satisfactòriament a models polinòmics lineals de segon ordre.<br/>En referència a l'encapsulció dels fàrmacs en liposomes: <br/>· La relació màxima d'encapsulació del DT en L és de 4,74 mg DT/g F (1:60 DT:F mol/mol) independentment de la grandària de les vesícules. L'estabilitat química de les preparacions és molt baixa (<7 dies) en qualsevol de les formes de presentació obtingudes (suspensions, liofilitzats, pro-liposomes). La degradació del fàrmac està afavorida per la presència de fosfolípids insaturats. En l'assaig d'irritació in vitro els L amb DT mostren un grau d'irritació lleugerament inferior al causat per una crema comercial de referència. <br/>· La relació màxima d'encapsulació de l'HC en L és de 25,8 mg HC/g F (1:19 HC:F mol/mol) independentment de la grandària de les vesícules. Les suspensions mostren inestabilitat física (aprox. 200 dies). Els estudis d'espectrometria d'infraroig (FT-IR) posen de manifest l'establiment d'enllaços d'hidrogen entre els grups OH de l'HC i els grups fosfat dels F, de manera que el fàrmac es situa a la zona polar de les bicapes (B), actuant com a disruptor. En L unilamel·lars obtinguts per fase reversa s'observa una sobresaturació transitòria (aprox. 12 hores) de les B amb HC. La interacció HC-F és feble, i s'observa una ràpida pèrdua del fàrmac en diluir les mostres.<br/>· La relació màxima d'encapsulació de l'HBP en L és de 47,9 mg HBP/g F (1:13 HBP:F mol/mol) independentment de la grandària de les vesícules. Les diferents formulacions (suspensions, hidrogels, liofilitzats) presenten una bona estabilitat química, en particular les liofilitzades (aprox. 10 anys). Els estudis d'FT-IR no detecten enllaços d'hidrogen entre l'HBP i els F. L'aplicació de suspensions de L amb HBP en humans provoca l'emblanquiment de la pell com a conseqüència de l'efecte vasoconstrictor del fàrmac, però no produeix cap disminució estadísticament significativa de la inhibició de la urticària de contacte amb nicotinat de metil (mesurat amb velocimetria de làser Doppler). Aquests resultats s'han associat als efectes d'adsorció/desorció d'aigua a l'estrat corni. Els estudis histomètrics amb ratolins tractats amb L amb HBP posen de manifest la producció d'atròfia cutània en diversos teixits, un efecte secundari del fàrmac relacionat amb la seva potència vasoconstrictora. Els resultats confirmen que els L actuen com a vehicle de l'HBP per aplicació tòpica.<br/>· S'obtingueren emulsions o/w amb OB al 2 % p/p estabilitzades amb F emprant el M110S. Les preparacions (emulsions, hidrogels i liofilitzats) presenten una bona estabilitat. El tipus de vesícules presents a les emulsions (L i microgotes) depèn de la relació inicial OB/F.

El trabajo describe, principalmente, la preparación de suspensiones de liposomas (L) con diferentes fármacos encapsulados (ditranol: DT; hidrocortisona: HC; y butirato-propionato de hidrocortisona:HBP) así como la de emulsiones o/w con aceite de borrajas (OB/agua) estabilizadas con fosfolípidos (F). Estas formulaciones tienen interés dermatológico y los métodos de obtención utilizados son directamente transferibles a la producción industrial. Previamente a la encapsulación de los fármacos en liposomas y a la preparación de las emulsiones fue necesario realizar los siguientes estudios:<br/>1.- El efecto de la concentración de F, del diámetro de los liposomas y de la concentración de sacarosa en la liofilización de las vesículas. Los resultados muestran que únicamente los liposomas pequeños (&#8804;100 nm) tienen poca estabilidad física durante la liofilización, aumentado notablemente su diámetro una vez rehidratados.<br/>2.- La estabilidad de los L en hidrogeles obtenidos con Carbopol 940. Se pudo comprobar que todos los liposomas estudiados fueron estables en dicho gel.<br/>3.- La determinación de las condiciones de análisis del tamaño de las vesículas mediante la detección heterodina del espectro de frecuencias de la luz dispersada. El instrumento utilizado fue el Microtrac UPA 150 (UPA). En referencia a esta técnica se comprobó que loas análisis de tamaño con el UPA 150 deben cumplir las siguientes restricciones: <br/>a) un tiempo de lectura &#8805; 10 minutos; <br/>b) un índice de carga situado entre 0,1 i 1; <br/>c) la necesidad de trabajar en el intervalo lineal de la relación concentración de les muestras-índice de carga; <br/>d) la fracción en volumen de la fase continua debe ser &#8805; 0,97; <br/>e) se deben apantallar las cargas eléctricas que puedan tener las vesículas. En caso contrario, se producen alteraciones de su distribución de velocidades, obteniéndose análisis erróneos.<br/>4.- La puesta a punto de la obtención de vesículas con un homogenizador a alta presión escalable a nivel industrial, el Microfluidizer 110S (M110S). Los resultados muestran que el control del número de ciclos de procesamiento, la presión de trabajo, la fuerza iónica del medio acuoso de la suspensión, la concentración de etanol (en caso de formar parte de la formulación) y la concentración de F permiten determinar con precisión las características de la población de L obtenidos con el M110S. El diámetro, la dispersión de la población y el volumen encapsulado de las vesículas se ajustan satisfactoriamente a modelos polinómicos lineales de segundo orden.<br/>En referencia a la encapsulación de los fármacos en liposomas:<br/>· La relación máxima de encapsulación del DT en L es de 4,74 mg DT/g F (1:60 DT:F mol/mol) independientemente del tamaño de las vesículas. La estabilidad química de las preparaciones es muy baja (<7 días) en todas de las formes de presentación obtenidas (suspensiones, liofilizados, pro-liposomas). La degradación del fármaco esta favorecida por la presencia de fosfolípidos insaturados. El ensayo de irritación in vitro muestra que los L con DT causan un grado de irritación levemente inferior al causado por una crema comercial de referencia.<br/>· La relación máxima de encapsulación de la HC en L es de 25,8 mg HC/g F (1:19 HC:F mol/mol) independientemente del tamaño de las vesículas. Las suspensiones muestran inestabilidad física (aprox. 200 días). Los estudios de espectrometría de infrarrojo (FT-IR) ponen de manifiesto la existencia de enlaces de hidrógeno entre los grupos OH de la HC y los grupos fosfato de los F, de manera que el fármaco se sitúa en la zona polar de las bicapas (B), inestabilizándolas. En L unilamelares obtenidos por fase reversa se observa una sobresaturación transitoria (aprox. 12 horas) de las B con HC. La interacción HC-F es débil, y se observa una rápida pérdida del fármaco al diluir las muestras.<br/>· La relación máxima de encapsulación del HBP en L es de 47,9 mg HBP/g F (1:13 HBP:F mol/mol) independientemente del tamaño de las vesículas. Las diferentes formulaciones (suspensiones, hidrogeles, liofilizados) presenten buena estabilidad química, en particular las liofilizadas (aprox. 10 años). Los estudios de FT-IR no detectan enlaces de hidrógeno entre el HBP y los F. La aplicación de suspensiones de L con HBP en humanos provoca la decoloración de la piel a consecuencia del efecto vasoconstrictor del fármaco, pero no produce una disminución estadísticamente significativa de la inhibición de la urticaria de contacto con nicotinato de metilo (medida por velocimetría de láser Doppler). Estos resultados se han asociado a los efectos de adsorción/desorción de agua en el estrato córneo. Los estudios histométricos con ratones tratados con L con HBP ponen de manifiesto la producción de atrofia cutánea en diversos tejidos, un efecto secundario del fármaco relacionado con su potencia vasoconstrictora. Los resultados confirman que los L actúan como vehículo del HBP para la aplicación tópica.<br/>· Se obtuvieron emulsiones o/w con OB al 2 % p/p estabilizadas con F utilizando el M110S. Las preparaciones (emulsiones, hidrogeles y liofilizados) presentan alta estabilidad. El tipos de vesículas presentes en las emulsiones (L y microgotas) dependen de la relación inicial OB/F.

This work describes the preparation of drug-loaded liposome (dithranol: DT; hydrocortisone: HC; hydrocortisone butyrate-propionate: HBP) liposome (L) suspensions and o/w phopholipid stabilized emulsions (borage oil: BO/water). All preparations are of great interest in dermatology, and they were obtained using scale-up methods. In order to obtain the previously described formulations the following studies were performed: <br/>1.- Study of the effect of the F concentration, the L diameter and the sucrose concentration on the physical L stability during lyophilization. The results show that the small L (&#8804;100 nm) have a very low stability during lyophilization.<br/>2.- Study of the effect of Carbopol 940 (hydrogel) on the L stability. The study shows that all the L tested were stable in Carbopol 940 hydrogel preparations.<br/>3.- Determination of the factors involved on the measurement of the liposome diameter using the "Microtrac UPA 150 (UPA)", an heterodyne detector spectrometer of sample scattered light. Results indicate that UPA vesicle-sizing analysis have to observe the next conditions: <br/>a) a minimum run time of 10 minutes; <br/>b) a loading index between 0.1 and 1; <br/>c) a lineal relation between sample concentration and the loading index; <br/>d) a continuous phase volume fraction &#8805; 0.97;<br/>e) the vesicle electrical charge have to be screened. Otherwise, velocity distribution is disturbed and the analysis are not correct.<br/>4.- Conditions for the preparation of L using a the high-pressure homogenizer "Microfluidizer 110S (M110S)". It was found that, using experimental design methods, the characteristics of the L obtained with the M110S depends on the control of the number of cycles, pressure, ionic strength, ethanol concentration and P concentration. The diameter, dispersion and entrapped volume of L have a good fit with lineal second order polynomial models.<br/>Regarding the drug entrapment in liposomes, results indicate that:<br/>· The maximum amount of DT entrapped in L has a ratio of 4.74 mg DT/g P (1:60 DT:P mol/mol) and it is not dependent on L diameter. In all preparations (suspensions, lyophilized and pro-liposome) the chemical stability was very low (< 7 days). Drug degradation is increased by unsaturated P. In vitro irritation test show that DT entrapped in L causes less irritation than that produced by a commercial cream.<br/>· The maximum amount of HC entrapped in L has a ratio of 25.8 mg HC/g P (1:19 HC:P mol/mol) and it is not dependent on the L diameter. The suspensions are physically unstable (&#8764;200 days). Infrared spectrometry (FT-IR) experiments detect hydrogen bonds between OH groups of drug and P phosphate group. These results suggest that HC is localized in the polar domain of the lipid bilayer and has a disrupter effect. A temporally bilayer supersaturation (&#8764;12 hours) with HC is observed in unilamellar L obtained by reverse phase evaporation. HC-P interactions are weak, and a fast drug desencapsulation is observed when the samples are diluted.<br/>·The maximum amount of HBP entrapped in L has a ratio of 47.9mg HBP/g P (1:13 HBP:P mol/mol) and it is not dependent on L diameter. The suspensions, hydrogels and lyophilized samples show chemical stability, specially the last ones (>10 years). FT-IR experiments do not detect any hydrogen bond between drug and P. Topical treatment with humans show a blanching effect on the skin due to the drug vasoconstrictor properties. However, the inhibition of the methyl-nicotinate-induced skin inflammation is not statistically significant (as has been shown for laser Doppler flowmetry). The last results are associated with adsorption/desorption phenomena in the skin stratum corneum. On the other hand, hystometric results of L-drug treated skin mouse show the atrophogenicity of the preparation, a secondary effect of topical corticosteroids related with their potency. Results confirm that L are an effective topical drug delivery system.<br/>· P stabilized o/w emulsions with 2% w/w BO were obtained with the M110S. Emulsions, hydrogels and lyophilized samples show a good stability. Vesicle composition (L and droplets) are dependent on the initial BO/P ratio.