Paper de les Proteïnes P110, P140, MG312 i MG217 en l'Estructura i Funció de l'Organela Terminal de Mycoplasma genitalium

Abstract

La tesis que es presenta comprèn tres treballs d'investigació independents, connectats entre sí per un mateix fil conductor: l'estudi de l'estructura i funció de l'organela terminal de Mycoplasma genitalium.<br/>En el primer treball s'han obtingut i caracteritzat mutants deficients per les proteïnes P140 i P110. Aquests estudis han revelat que les proteïnes P140 i P110 estan estabilitzades de forma recíproca, són els principals determinants de citadherència i la seva presència és necessària per al desenvolupament de l'organela terminal. A més, l'absència d'aquestes dues proteïnes també promou la inestabilitat de la proteïna de motilitat MG386 i un increment en els nivells de la proteïna DnaK. Per altra banda, també s'han analitzat un conjunt de mutants espontanis en adhesió cel·lular que apareixen amb una elevada freqüència. Aquest anàlisi ha permès determinar que aquests mutants s'originen com a conseqüència de grans delecions afectant als gens codificants de les proteïnes P140 i P110. A més, s'ha demostrat que aquestes delecions són producte de recombinacions entre seqüències dels gens afectats i seqüències repetides que es troben distribuïdes al llarg del genoma. Aquest origen recombinatiu explica l'alta freqüència d'aparició d'aquests mutants i obre la possibilitat de l'existència d'un mecanisme general de variació de fase de l'expressió de les proteïnes P140 i P110. <br/>En el segon treball s'ha investigat el paper de la proteïna MG312 en l'arquitectura i funció de l'organela terminal. Aquest estudi ha permès determinar que aquesta proteïna és un component estructural bàsic de l'organela terminal, essencial per al manteniment de la integritat d'aquesta estructura i d'alguns dels seus components. Com a conseqüència, els mutants deficients per la proteïna MG312 no desenvolupen organeles terminals, són parcialment deficients en adhesió i completament immòbils. D'altra banda, també s'ha analitzat la implicació de diferents dominis en la funció de la proteïna MG312. En general, aquest estudi ha permès identificar dos dominis funcionals importants: un domini C-terminal que manté la integritat estructural de l'organela terminal i un domini N-terminal amb una implicació més específica en motilitat i/o divisió cel·lular. També s'ha analitzat la implicació específica dels motius EAGR i Walker A presents en el domini N-terminal. Per últim, la proteïna MG312 ha estat expressada de forma recombinant. Estudis de microsocòpia electrònica sobre la proteïna recombinant indiquen que aquesta proteïna mostra una notable semblança estructural amb les proteïnes SMC, implicades en el manteniment estructural dels cromosomes. <br/>En el tercer i últim treball s'ha abordat la identificació de gens involucrats en el control del moviment dels micoplasmes. Es descriu el desenvolupament d'un mètode, que ens ha permès aïllar un mutant deficient per la proteïna MG217 i que exhibeix alteracions en els patrons de moviment. Les dades obtingudes de la caracterització d'aquest mutant indiquen que la proteïna MG217 és un nou component de l'organela terminal implicat en promoure la inclinació d'aquesta estructura respecte el cos cel·lular. De manera interessant, aquestes alteracions en el grau d'inclinació de l'organela terminal es correlacionen amb els canvis observats en els patrons de moviment, suggerint que l'organela terminal actua com a un timó i determina la direcció del desplaçament dels micoplasmes.

This thesis is composed of three independent research works focused on the study of the structure and function of the terminal organelle in Mycoplasma genitalium.<br/>In the first work, we obtained and characterized P140 and P110 deficient mutants. These studies revealed a reciprocal posttranslational stabilization between P140 and P110 proteins, and that these proteins are required for cell adhesion and terminal organelle development. Loss of either P140 or P110 also correlates with decreased levels of the MG386 motility related protein and increased levels of the DnaK protein. In addition, several cytadherence-negative mutants that appear spontaneously at unexpectedly high rates were also examined. We found that these mutants were originated as a consequence of large deletions affecting the P140 and P110 coding genes. Furthermore, we demonstrated that these deletions are the product of recombination events involving sequences of the P140 and P110 coding genes and DNA repetitive elements that are distributed along the M. genitalium genome. The recombinative origin of these deletions provides a plausible explanation for the unexpectedly high rates of appearance of these mutants and opens the possibility of the existence of a phase variation mechanism to switch on and off the expression of the M. genitalium P140 and P110 cytadhesins. <br/>In the second work, we investigated the role of the MG312 protein in the function and architecture of the terminal organelle. We found that MG312 protein is a structural component essential to maintain the integrity of the terminal organelle and its components. As a consequence, MG312 deficient mutants loss the terminal organelle and exhibit an intermediate-cytadherence phenotype and a complete absence of gliding motility. On the other hand, we also examined the contribution of different domains in the MG312 protein function. This study allowed us to identify two separate and functional domains: a C-terminal domain implicated in the terminal organelle assembly functions and an N-terminal domain involved specifically in gliding motility and/or cell division. The specific contribution of the EAGR box and Walker A box found in the N-terminal region was also examined. Finally, MG312 was expressed in a recombinant way and its structure was analyzed by using electron microscopy. Images obtained showed that this protein exhibits a surprising structural similarity with SMC proteins, involved in the structural maintenance of chromsomes.<br/>In the third and last work we aimed to identify genes related to the regulation of the mycoplasma cell movement. We developed a straightforward procedure that allowed us to isolate a MG217 deficient mutant exhibiting an altered gliding behaviour pattern. Further characterization of this mutant revealed that the MG217 protein is a novel terminal organelle component involved in the curving of this structure in M. genitalium cells. Interestingly, changes in the tilt angle between the terminal organelle and the cell body correlates with the observed changes in the gliding behaviour, suggesting that the terminal organelle operates as a guide to steer the mycoplasma cell in specific directions.