BMP-6 i NMDA com a moduladors de la supervivència de les neurones granulars de cerebel: mecanismes implicats

Abstract

Les neurones granulars de cerebel es generen a la capa granular externa i es diferencien i migren a traves de la capa molecular per donar lloc a la capa granular interna durant el desenvolupament postnatal del cerebel. Durant aquest procés de maduració,aquestes neurones necessiten l'aportació constant d'estímuls tròfics. Si no és el cas, moren per apoptosi. Aquesta situació que es dóna in vivo és mimetitzable en un cultiu de CGCs. Aquestes neurones són sensibles a les concentracions extracel·lulars de potassi i moren per apoptosi quan són exposades a 5mM de KCl (K5). Per contra, si s'addiciona al medi factors que s'han descrit que participen del seu manteniment in vivo com IGF-1, BDNF, PACAP, l'estimulació amb l'agonista glutamatèrgic NMDA o KCl 25 mM (K25) aquestes es desenvolupen i sobreviuen durant el cultiu. <br/>Les BMPs tenen un paper important en la regulació de la diferenciació de les CGCs i se'ls hi ha atribuït efectes anti-apoptòtics en diferents sistemes. En aquest treball ens varem plantejar l'estudi de les BMPs com a possibles factors tròfics per les CGCs. BMP-6 protegeix les CGCs en front de K5 en estadis madurs del cultiu, mentre que BMP-2 i BMP-7 no. Les BMPs senyalitzen a traves de tetràmers de receptors tipus I i II i l'activació d'aquests promou l'activació i translocació al nucli de les proteïnes Smads. La maquinària de resposta a les BMPs s'expressa en les CGCs in vitro. Tot i així, no detectarem diferències en l'estat d'activació de les Smads en les diferents condicions testades. La supervivència d'aquestes neurones s'ha relacionat principalment a l'activació de tres vies de cinases com són la PI3K-Akt, la via de MEK/ERK i la de JNK. Varem estudiar el grau d'activació d'aquestes en K5 i la possible modulació pel tractament amb BMP-6. Mentre que el tractament amb BMP-6 no produeix diferències en l'activació de les vies PI3K-Akt i JNK, sí que indueix una forta activació a temps curts de la via MEK/ERK quan es compara amb K5. Mitjançant l'ús d'inhibidors de la via hem observat com aquesta és la principal mediadora de l'efecte de BMP-6. En aprofundir en la senyalització que es desencadena per sota l'activació de MEK/ERK hem identificat a CREB com a factor de transcripció involucrat en l'efecte. La seva activació resulta en la regulació a l'alça dels nivells de la proteïna anti-apoptòtica Bcl-2 que resulta en la inhibició de l'activació de la caspasa-3 per K5 i la reducció dels nuclis apoptótics. Per altre banda, en la recerca del nexe d'unió entre l'activació del receptor i l'activació de la via MEK/ERK també hem descrit com BMP-6 és capaç d'activar a Rap-1 deixant la porta oberta a la participació d'aquesta proteïna G monomèrica en l'efecte de BMP-6. Així doncs, les nostres dades suggereixen un paper nou de BMP-6 com a factor tròfic en el desenvolupament de les CGCs i que realitzaria aquesta funció a través de l'activació de la via MEK/ERK/CREB. <br/>El tractament amb NMDA promou la supervivència de les CGCs en cultiu. Estudis previs en el nostre laboratori i en altres han relacionat l'activació de la via de PI3K-Akt i la inhibició de JNK amb l'efecte protector del NMDA. L'activació o inhibició de vies de cinases cursa en la modulació de l'activitat de factors de transcripció que resulta en canvis en el transcriptoma. Així, varem estudiar els canvis en l'expressió gènica induïts pel tractament amb NMDA.. Varem observar una inducció de gens corresponents a programes de desenvolupament neuronal, neurogènesi i anti-apoptosi. Mitjançant estudi comparatiu amb el treball de Zhang i cols. obtinguérem una llista de candidats a mediar l'efecte del NMDA: atf3, bdnf, cdp, Crem, Fos, Homer1, Nfil3, Pcsk1, Plagl1, Rem2, Snf1lk, vgf i NR4A1-3(Nur77, Nurr1 i NOR-1). Tot i que tots ells presentaven funcions relacionables amb supervivència cel·lular, ens varem centrar en l'estudi dels membres de la família de NR4a pel seu paper desconegut en el desenvolupament del cerebel. Encara que l'expressió dels missatgers de Nur77, Nurr1 i NOR-1 es correspon amb les dades del array, a nivell proteic només Nurr1 presenta una pujada en els seus nivells després del tractament amb NMDA. La reducció dels nivells de Nurr1 mitjançant shRNA resulta en una reducció de l'efecte de NMDA. Tanmateix, hem descrit que CREB és el responsable de la inducció de Nurr1 en resposta a NMDA i que la reducció en l'efecte del NMDA en presència del shRNA de Nurr1 ve acompanyat per una reducció en els nivells de BDNF. A més a més, Nurr1 i BDNF presenten un patró d'expressió correlatiu en el cerebel durant els dies postnatals que s'atribueixen a la migració de les CGCs des de la EGL a la IGL. Donant força a Nurr1 com a mediador de l'efecte supervivència de l'estimulació del NMDAR durant el desenvolupament del cerebel.

Cerebellar granule neurons (CGCs) are generated in the external granule layer (EGL) and they differentiate and migrate trough the molecular layer to form the internal granule layer (IGL) during the postnatal development of the cerebellum. During its maturation they need trophic support to survive. Otherwise, they die by apoptosis. That situation that occurs in vivo can be mimicked in a culture of CGCs. These neurons are sensitive to extracellular potassium concentrations and they die by apoptosis when they are exposed to low potassium concentrations (5 mM KCl, K5). In contrast, the presence in the media of molecules that have been described to participate in hte maintenance of these neurons in vivo like IGF-1, BDNF, PACAP, glutamatergic stimulation with the agonist NMDA or depolarizing concentrations of potassium promote the survival of CGCs during the days in vitro.<br/>BMPs have an important role in the regulation of CGCs differentiation and they have been described to promote survival against some pro-apoptotic paradigms. In these work we planned to study the eventual effect of BMPs on CGCs survival. BMP-6 protects from K5 induced apoptosis while BMP-2 and -7 do not. We analyzed the presence of the cannonical signaling machinery associated to BMPs in the CGCs in vitro and we observed that all the elements where expressed. However, they do not participate in BMP-6 effect as we do not observe an increase in the nuclear localization of smads in presence of BMP-6. The survival of CGCs have been closely related with the activation status of some signaling pathways like JNK, PI3K/Akt and MEK/ERK. In order to see if they where involved in BMP-6 effect we analyzed their activation. We didn't detect any difference in the JNK and PI3K/Akt pathways in presence or absence of BMP-6. By contrast MEK/ERK pathway was activated in BMP-6 treated cells. We Took in advance of inhibitors to determine the participation in BMP-6 effect and we observed that BMP-6 was mediate by MEK/ERK pathway. We went further in the study of the signaling involved in BMP-6 effect and we have described that CREB is downstream of MEK/ERK pathway activation and that its activation promotes an increase in Bcl-2 levels that results in the inhibition of caspase-3 induced activation of K5 and the reduction of apoptotic nuclei. Moreover, we show that Rap-1 can be a good candidate to be mediating MEK/ERK activation after BMP-6 treatment. Taking together, our data suggest that BMP-6 could be participating in CGCs maintenance during their development in vivo an that this function would be performed by the activation of MEK/ERK/CREB pathway.<br/>NMDA treatment promotes CGCs survival in culture. Previous studies in our laboratory have related the activation of PI3K/Akt and the inhibition of JNK with NMDA protective effect. The activation and inhibition of these pathways results in changes in the activation status of transcription factors that promote changes in the transcriptome. In order to analyze the expression changes after NMDA treatment we performed an array with the Genechip® Rat genome 230 Affymetrix platform. We found an enrichment of neuronal development, neurogenesis and anti-apoptotic programs. Moreover, we performed a comparative analysis with the work of Zhang and cols (Zhang et al., 2007) and we obtained a list o f candidates to mediate NMDA effect: atf3, bdnf, cdp, Crem, Fos, Homer1, Nfil3, Pcsk1, Plagl1, Rem2, Snf1lk, vgf i NR4A1-3(Nur77, Nurr1 i NOR-1). All of them are involved in cellular processes that could be related to CGCs survival. However, we focused our attention in Nr4a subfamily members as their role in cerebellum development haven't been explored. We detected the increase in the expression of Nur77, Nurr1 i NOR-1, although only Nurr1 protein levels were increased in presence of NMDA. Reduction of Nurr1 levels by shRNA revealed its participation in NMDA neuroprotection. Additionally, we described that Nurr1, regulated by CREB in NMDA treated cells, promotes an increase in BDNF levels to develop its function in NMDA effect. We also performed a translation to the in vivo situation and as a first approach we studied the expression of Nurr1 and BDNF in the cerebellum during the postnatal development. Both proteins present a similar kinetic and they are induced in the time that is believed to be when CGCs migrate from the EGL to the IGL. In conclusion, this is the first time that Nurr1 have been described as a mediator of NMDA neuroprotection and our results suggest that this situation could be also occurring in vivo.