Avenços en la fisiopatologia de la Leucoencefalopatia Megalencefàlica amb Quists subcorticals

Abstract

La Leucoencefalopatia Megalencefàlica amb quists subcorticals (MLC) és un tipus de leucodistròfia espongiforme d'herència autosòmica recessiva. Està considerada una malaltia rara que es caracteritza per macrocefàlia els primers anys de vida, deteriorament de les funcions motores, atàxia i espasticitat, lleuger retràs mental i en alguns casos atacs epilèptics. El diagnòstic es fa per ressonància magnètica d'imatge ja que els pacients presenten la substància blanca anormalment difusa i quists subcorticals a la regió anterio-temporal i fronto-parietal. Es va descriure el primer gen causant de la malaltia, MLC1 mapat al cromosoma 22qtel, del qual s'han descrit més de 60 mutacions diferents. Però existeix un 20% dels pacients de MLC que no presenten mutacions en aquest gen, suggerint més d'un gen implicat a la malaltia. En l'actualitat encara no es coneix la funció de la proteïna MLC1. L'expressió de MLC1 és bàsicament en el sistema nerviós en ratolí, a astròcits i neurones. En la present tesi s'han generat tres anticossos contra la proteïna humana MLC1 per tal de caracteritzar l'expressió i localització de MLC1 en humans. MLC1 s'expressa a sistema nerviós central i perifèric en adult, principalment a astròcits perivasculars i concretament en la membrana en contacte entre els astròcits, amb petites diferències en l'etapa fetal on és predominantment expressió neuronal. Trobem una sobreexpressió de MLC1 en la zona de penombra en condicions d'infart cerebral. S'ha desenvolupat dos models cel·lulars per estudiar la fisiopatologia de MLC1. En el model primari d'astròcits, MLC1 es localitza als processos astrocitaris entre astròcits en unions complexes, formades per proteïnes d'unions tight, gap i adherents, colocalitzant i co¬immunoprecipitant amb ZO-1 i GlialCAM. La seva localització depèn dels microfilaments d'actina. En el model primari de neurones, MLC1 està localitzat al tracte axonal. L'estudi de les mutacions de MLC1 en el model astrocitari provoquen un defecte de plegament amb la retenció de la proteïna a reticle endoplasmàtic, sense poder arribar a membrana. MLC1 s'expressa a monòcits de sang perifèrica, una nova eina pel diagnòstic dels pacients. L'estudi de pacients de MLC amb diferents mutacions revelen una manca total de la proteïna MLC1. El model astrocitari knock-down de MLC1, utilitzant la tecnologia de RNA d'interferència i adenovirus, presenta canvis morfològics en els astròcits. La manca de MLC1 provoca una reducció de la mida cel·lular i l'aparició de vacuoles intracel·lulars. La seva expressió i localització es veu alterada per condicions hipoosmòtiques del medi. La sobreexpressió de MLC1 provoca un augment en la permeabilitat de l'aigua en els astròcits i una disminució de la capacitat de recuperar el volum cel·lular RVD (regulatory colume decrese) en condicions hipoosmòtiques, i en condicions fisiològiques, produeix una major sortida d'aspartat dels astròcits degut a l'activació dels VRACs (volume.regulated anion channels). La nostre hipòtesi és que MLC1 podria actuar com un canal d'aigua, un canal/transporador de Cl-o K+, o un VRAC.

Megalencephalic leukoencephalopathy with subcortical cysts (MLC) is a type of spongiform leukodystrophy with an autosomal recessive inheritance. It is considered a rare disease characterized by early life macrocephaly, impaired motor functions, ataxia and spasticity, slight mental delay and some cases of seizures. Magnetic resonance imaging is used as diagnostic of patients and shows abnormally diffuse white matter and subcortical cysts in the anterio-temporal and fronto-parietal regions. We describe the first gene causing the disease; MLC1 is mapped to chromosome 22qtel, which have been described more than 60 different mutations. But there is 20% of MLC patients who have no mutations in this gene, suggesting more than one gene involved in disease. The function of MLC1 protein is unknown. The expression of MLC1 is basically in the nervous system in mice, in neurons and astrocytes. In this thesis, we have generated three antibodies against MLC1 human protein to characterize the expression and localization of human MLC1. MLC1 is expressed in central and peripheral nervous system in adults, mainly in perivasculars astrocytes and specifically in the membrane contact between cells, with small differences in the fetal stage where it is predominantly neuronal expression. We found an overexpression of MLC1 in the penumbra zone of a cerebral stroke. We have developed two cell models to study the pathophysiology of MLC1. In the primary astrocytes model, MLC1 is localized in the astrocytic processes between astrocytes, in a complex junctions formed by proteins of tight, gap and adherent junctions, interacting with ZO-1 and GlialCAM. Its location depends on the actin microfilaments. In the model of primary neurons, MLC1 is located in axonal tracts. In the astrocytes model, mutations in MLC1 cause protein folding defects and an endoplasmic reticulum retention, unable to reach membrane. MLC1 is expressed in peripheral blood monocytes, a tool for the diagnosis of patients. Studies of different MLC1 mutations in patients with MLC reveal a total lack of MLC1 protein. The astrocyte knock-down model of MLC1, using RNA interference and adenovirus technology, produces cell morphological changes. The lack of MLC1 causes a reduction in cell size and the appearance of intracellular vacuoles. The expression and localization is altered by hypoosmotical extracellular conditions. In this conditions, the overexpression of MLC1 causes an increase in the permeability of water in astrocytes and a reduced ability to recover the cellular volume RVD (regulatory volume decrease), and under physiological conditions, it triggers a greater efflux of aspartate due to the activation of VRACs (volume-regulated anions channels). Our hypothesis is that MLC1 could act as a water channel, a channel or transporter of Cl-or K+, or a VRAC.