Estratègies de co-transformació per eliminar els gens de selecció i avaluació del flux de gens en plantes transgèniques d'arròs

Abstract

En el procés de transformació genètica tan sols un petit percentatge de cèl·lules accepta la integració de DNA forà mentre que la majoria de cèl·lules romanen com a no transgèniques. Habitualment s'introdueix juntament amb el gen d'interès un gen de selecció, que permet el creixement únicament de les cèl·lules transformades. Fins ara els gens de selecció més utilitzats són els que confereixen resistència a antibiòtics o a herbicides. A més dels possibles riscs sanitaris i/o mediambientals que pot comportar l'ús d'aquests gens (fins ara no demostrats) hi ha una normativa europea (EU 2001/18/EC) que en prohibeix l'ús. A nivell científic, la presència d'aquests gens és totalment prescindible un cop s'han seleccionat les cèl·lules transformades. Per tot això, en els darrers anys s'han establert diverses estratègies per eliminar els gens de selecció en plantes transgèniques. <br/>Aquest treball s'ha centrat en estudiar diferents vies de co-transformació de dos gens, el d'interès i el de selecció, amb la finalitat d'establir el millor sistema per obtenir per segregació de caràcters en la descendència, plantes transgèniques d'arròs (Oryza sativa L.) lliures de gens de selecció. S'han utilitzat gens marcadors de fàcil identificació com el gen gfp (green fluorescent protein), el gen bar (resistència al herbicida glufosinat d'amoni) i el gen uidA (?-glucuronidasa) per obtenir les taxes de co-transformació en T0 i per avaluar la segregació de caràcters en T1. S'han dissenyat diferents estratègies de co-transformació tan per Agrobacterium tumefaciens com per biolística.<br/>Mitjançant la transformació genètica per Agrobacterium tumefaciens s'ha provat a) la inoculació del call d'arròs amb dues poblacions d'Agrobacterium, cadascuna portadora d'un plàsmid amb un gen marcador diferent. Les inoculacions s'han realitzat simultàniament en el temps i deixant dos i cinc dies de decalatge entre una i altra; b) inoculació amb una soca d'Agrobacterium portadora de dos plàsmids, cadascun amb un gen marcador; i c) inoculació amb una soca d'Agrobacterium portadora d'un plàsmid amb dues regions de DNA de transferència, el doble T-DNA. Per biolística s'han realitzat experiments en què en comptes de disparar amb plàsmids sencers s'ha fet amb DNA monocatenari. Les aplicacions dels T-DNA monocatenaris es van realitzar simultàniament en el temps i amb decalatge de dos i cinc dies. <br/>Els resultats dels estudis de les estratègies portades a terme per Agrobacterium tumefaciens van ser els següents: inoculant simultàniament amb dos cultius bacterians es va obtenir una taxa de co-transformació baixa però suficient per permetre l'obtenció de plantes descendents que segreguin pels dos caràcters. En canvi, l'estratègia de deixar temps de decalatge entre les inoculacions no va afavorir la inserció del nou caràcter en un locus independent sinó que els resultats suggereixen que el teixit vegetal podria activar mecanismes de defensa que bloquegen una segona inserció de material genètic a curt termini. No va resultar efectiva l'estratègia d'inocular amb una soca bacteriana portadora de dos plàsmids diferents segurament per la gran similitud entre els dos plàsmids utilitzats, implicant el desplaçament d'un dels dos plàsmids i impossibilitant l'obtenció de plantes co-transformades. Tot i que caldria ajustar alguns paràmetres per obtenir els resultats esperats per biolística, s'ha demostrat la funcionalitat d'almenys un dels T-DNA monocatenaris. Finalment l'estratègia que va resultar més eficaç i viable va ser la del doble T-DNA, obtenint una taxa de co-transformació del 69'7% amb plantes que a més havien integrat en la majoria dels casos entre una i dues còpies de cada gen. La tècnica del doble T-DNA ens ha permès obtenir diverses línies homozigòtiques de plantes d'arròs portadores d'un dels gens marcadors lliures de gens de selecció. Aplicant la tècnica del doble T-DNA es va substituir un dels gens marcadors per un gen d'interès, el CryIB, que codifica per una endotoxina de Bacillus turingensis, que confereix resistència a la planta transgènica enfront al barrinador de l'arròs Chilo supressalis,. Amb l'estratègia del doble T-DNA es van obtenir plantes d'arròs amb el gen d'interès CryIB i sense gens de selecció.<br/>Un altre aspecte que s'ha abordat a la tesi és l'estudi de flux genètic entre plantes transgèniques d'arròs, plantes no transgèniques i arròs salvatge. En aquest sentit és va dissenyar un experiment en camp per confirmar els resultats obtinguts en assaigs anteriors sobre l'efecte de la distància i dels vents dominants en l'encreuament entre plantes transgèniques i plantes no transgèniques de la mateixa varietat d'arròs, així com avaluar la taxa d'encreuament amb l'arròs salvatge situat entremig del camp o bé a diferents distàncies. Els resultats obtinguts, juntament amb les característiques particulars de les varietats d'arròs suggereixen que la coexistència és possible entre cultius transgènics, tradicionals i ecològics d'arròs. Tanmateix, en el cas de l'arròs salvatge les mesures de coexistència hauran d'incloure, molt probablement, alguna estratègia que permeti minimitzar la presència d'aquesta mala herba als camps d'arròs.

In genetic transformation process only a few percentages of cells accept the integration of foreign DNA while most cells remain non-transformed. Usually a selection gene is introduced together with the gene of interest, allowing the growing of transformed cells only. Until now, the most frequently used selection genes are those that confer antibiotic or herbicide resistance. Apart from the potential health and/or environmental risks (presently still not demonstrated) there is a European regulatory law (EU 2001/18/EC) that forbids the use of antibiotic selection genes. At a scientific level, the presence of these kinds of genes is absolutely not necessary once the transformed cells have been selected. For all these reasons, some strategies have been established in recent years in order to eliminate the selection genes of transgenic plants. <br/>The aim of this thesis was to study different ways of co-transformation to obtain transgenic rice (Oryza sativa L.) without selection genes, throughout the segregation in the progeny. Easily identifiable reporter genes such as gfp (green fluorescent protein), bar (ammonium glufosinate resistance) and uidA (?-glucuronidase) have been used to obtain co-transformation ratios in the T0 and to evaluate characters segregating in the T1 generation. Different strategies of co-transformation by Agrobacterium tumefaciens as well as have been designed. <br/>By using Agrobacterium tumefaciens genetic transformation system we have tested a) inoculation of rice embriogènic callus with two populations of Agrobacterium, each one carrying a vector with a different reporter gene. The inoculations have taken place simultaneously and with a time range of two and five days between them; b) inoculation with one population of Agrobacterium tumefaciens carrying both types of vectors, each one with it's own reporter gene; and c) inoculation of an Agrobacterium population carrying a vector with two T-DNA regions, each one with a different reporter gene. By biolistics we have experimented shooting with single stranded fragments of DNA instead of whole plasmids. The applications of the single-stranded T-DNA have taken place simultaneously and in range of time of different days. <br/>The results obtained with the different Agrobacterium tumefaciens strategies were the following: by inoculating simultaneously with two bacterial cultures we had a low co-transformation ratio but this was enough to obtain plants in the progeny segregating for both characters. However, the range time strategy between different inoculations did not favor the insertion of the second T-DNA far from the first one. These results suggest that vegetal tissue could activate some defense mechanism that blocks a second introduction of genetic material in a short time. The strategy based in inoculating with an Agrobacterium population carrying two types of plasmids was not effective, probably due to the important similarity of the used plasmids that could lead to the high replication of one of them in comparison with the other one, making impossible to have co-transformed plants. Although it would be necessary to adjust some parameters to obtain the expected results by bioballistics, we have demonstrated the functionality of at least one of the single-stranded T-DNA shouted. Finally, the most effective strategy was the double T-DNA system that gave rise to a co-transformation ratio of 69.7% with plants that had integrated in the most part of them one to two copies of each gene. The double T-DNA system allowed us obtaining some homozygous rice plants carrying one of the reporter genes without selection gene. Applying the double T-DNA technique, one of the cassettes was substituted by a cassette carrying the CryIB gene that codifies for an endotoxin from Bacillus thuringensis, conferring resistance to the stem borer Chilo suppressalis. With this strategy we have obtained rice plants with the gene of interest CryIB and free from selection genes. <br/>Another aspect studied in this thesis was the gene flow between transgenic rice plants and conventional rice and the red rice weed. An experimental field has been designed to confirm the results obtained in previous experiments on the effect of distances and prevalent winds in cross-pollination between transgenic and non transgenic rice plants. Moreover, out-crossing between transgenic rice and the red rice weed placed into transgenic field or at different distances was studied. The obtained results, with the particular traits of rice cultivars, suggest that coexistence is possible between transgenic, traditional and organic rice cultivars. However, in the case of the red rice weed, the measures of coexistence would probably have to include some strategy that permit minimize the presence of that weed in rice fields.