Producción de eritrocitos a partir de células CD34+ de sangre de cordón umbilical

Abstract

El objetivo de este estudio es la generación ex-vivo de eritrocitos a partir de la maduración y diferenciación de células CD34+ purificadas de sangre de cordón umbilical. El desarrollo de la terapia celular y la generación de diferentes tipos celulares a partir de células madre ha abierto el campo a la producción de diferentes componentes sanguíneos, entre ellos los eritrocitos, a partir de células madre hematopoyéticas (células CD34+). Existen diferentes fuentes de células CD34+, siendo el cordón umbilical una fuente de fácil acceso y donde éstas presentan una mayor capacidad de expansión. La necesidad de incrementar la tasa de expansión y el paso de enucleación celular son los puntos clave para hacer realidad la posibilidad de generar sangre en el laboratorio que sea equiparable a una unidad de sangre donada. Se han diseñado diferentes estrategias para generar eritrocitos a partir de células CD34+ de sangre de cordón umbilical. Estas estrategias se han basado en la utilización de diferentes medios de cultivo, citocinas, concentraciones celulares y estrategias de cultivo. Para el paso final de enucleación se ha pasado de un co-cultivo sobre capa estromal de células mesenquimales a un cultivo en suspensión celular. Se ha puesto a punto una metodología de cultivo consistente en la combinación de un medio específico con estrategias de alimentación que permiten la expansión y diferenciación de células CD34+ de cordón umbilical a eritrocitos maduros. Todavía son necesarios más ajustes para incrementar la tasa de expansión y optimizar la fase de maduración final.

The aim of this study was the in vitro generation of red blood cells (RBC) from CD34+ cells purified from human umbilical cord blood, offering an alternative to classical transfusion products. Within the hematopoietic stem cell sources, umbilical cord is readily available and it has a greater expansion capacity. Such increase of the expansion capacity and the terminal differentiation efficiency are the key points in the generation of blood in the laboratory. We have tested different methodologies to generate erythrocytes from CD34+ cells from human umbilical cord blood. The parameters investigated related with the increase of the expansion capacity involved the use of different culture media, cytokines, cell seeding density and dilution steps. For the terminal differentiation and enucleation steps, the stromal layer co-culture was switched into a suspension culture with erythropoietin. The erythroid progenitors were characterized by the expression of the surface markers CD45, CD36, CD235 (glycophorin A) and CD71 (transferrin receptor). Enucleated cells were discriminated from nucleated cells by labeling the genetic content. May-Grünwald-Giemsa staining was used for morphological analyses. A culture methodology that combines a specific medium formulation and feeding strategy has been successfully developed in bioreactors allowing the expansion and differentiation of CD34+ cord blood to mature red blood cells. Further improvements are still needed in order to increase the expansion rate and to optimize terminal differentiation step.