Hacia una biología de la hernia incisional. Alteraciones celulares molecualres en el músculo y fascia humanos

Abstract

La hernia incisional (HI) es una complicación potencialmente grave y de elevada incidencia de las laparotomías. Se caracteriza por la pérdida de estructura y de función miofasciales y la eventual ruptura del tejido. De progresión lenta, conlleva una morbilidad importante y su reparación quirúrgica usando biomateriales es un desafío. Aunque se han identificado diversos factores de riesgo (dependientes de la técnica o del paciente), la etiología fundamental de la HI es desconocida. Por el momento, no hay modelos experimentales apropiados para el estudio los mecanismos iniciales de la enfermedad y así extrapolar hallazgos preclínicos. Debido a su coste socio-sanitario, y la posible mejora en su prevención, diagnóstico y tratamiento, tiene sentido desarrollar estudios descriptivos con los que poder generar nuevas hipótesis y habilitar una nueva medicina de precisión más basada en la evidencia.

En esta tesis nos hemos centrado en el estudio del nicho conectivo local, comparando muestras humanas peroperatorias derivadas de tejidos de la pared abdominal (fascia y músculo esquelético) de pacientes con historia de HI y pacientes control. El objetivo primordial del trabajo es avanzar en la comprensión de los mecanismos efectores (celulares y moleculares) implicados, y así poder contribuir a reducir el rango de variables candidatas asociadas al desarrollo y/o la predicción de la HI. Planteamos una investigación de tipo clínico orientada al paciente. De manera específica nos hemos centrado en tres ejes principales: 1.- Caracterización tisular, 2.- Caracterización de fibroblastos primarios in vitro; y, 3.- Evaluación de la respuesta fenotípica y funcional de dichos fibroblastos en sustratos de cultivo con propiedades mecánicas (rigidez) reguladas, con la intención de modelar in vitro las condiciones mecánicas del tejido humano afectado.

En el análisis de la caracterización tisular, demostramos alteraciones al nivel de la matriz extracelular (MEC) local (específicas de tejido), que en última instancia podrían ser las responsables de la pérdida tisular y de la eventual ruptura. Destaca la presencia de señales diversas de muerte celular en los tejidos de pacientes con HI, que probablemente podrían provocar la destrucción progresiva de los fibroblastos locales. Bajo un segundo objetivo hemos caracterizado fibroblastos primarios in vitro, identificando un funcionamiento alterado en los derivados de HI (HIFs). Demostramos que los HIFs adquieren in vivo un fenotipo diferencial que se mantiene en cultivo a lo largo de diferentes pases, y que afecta a procesos celulares fundamentales. Finalmente, sobre la base de este progreso y para obtener una imagen más completa de estos eventos, sabiendo que la patología local puede generar también cambios en las tensiones mecánicas de los tejidos, bajo un tercer objetivo y utilizando sustratos de propiedades mecánicas reguladas, hemos podido demostrar que cambios en la rigidez del sustrato son suficientes para provocar alteraciones fenotípicas y funcionales en los fibroblastos primarios estudiados. La respuesta difiere entre fibroblastos primarios derivados de pacientes con HI y fibroblastos derivados de pacientes control. Estos resultados confirman que la modulación de la rigidez del sustrato permite una aproximación in vitro al estudio de determinados aspectos de la fisiología de fibroblasto en respuesta a cambios de rigidez del tejido conectivo (i.e., presentes en la HI).

En conclusión, nuestros datos aportan evidencias indirectas pero convincentes de que el microentorno de la MEC local puede influenciar el desarrollo de la HI, actuando de una manera específica para cada tejido. Estos hallazgos pueden ser relevantes ayudando a identificar nuevos actores en el proceso HI, tal y como sucederían in vivo, y aportan información para poder definir nuevas dianas que podrían ayudar a diferentes niveles: a) mejor identificación y estratificación de paciente, b) mejora de resultados clínicos, c) contribuir a adaptar el diseño de biomateriales para mejorar el rendimiento clínico.

The incisional hernia (IH) is a potentially serious and high incidence complication of laparotomy. It is characterized by the loss of structure and function and eventual myofascial tissue breakdown. HI is a slowly progressive pathology, leading to significant morbidity, and surgical repair using biomaterials is a challenge. Even thought it has described several risks factors (technique or patient dependent), the primary aetiology for IH is unknown. At this time, no appropriate experimental models have been developed to study the initial mechanisms of disease, and then extrapolate the preclinical findings. Due to its social and health costs, and the possibility to improve the prevention, diagnosis and treatment of HI, it would be reasonable to develop descriptive studies to generate new hypotheses and enable a new precision medicine based on evidence.

In this thesis, we focused on the study of the local connective niche, comparing perioperative human samples derived from the abdominal wall tissue (fascia and skeletal muscle) in patients with a history of HI and control patients. The primary objective of this work is to advance the understanding of the effector mechanisms (cellular and molecular) involved in HI, and thus contributing to efforts to narrow the range of candidate variables associated with the development and / or prediction of the HI. We propose a patient-oriented clinical type research. Particularly, we have focused on three main subjects: 1. - Tissue characterization, 2. - Characterization of primary fibroblasts in vitro; and 3. - evaluation of phenotypic and functional response of before mentioned fibroblasts in culture substrates with mechanical regulated properties (stiffness), with the aim of modelling the in vitro mechanical conditions of the human tissue affected.

In the analysis of tissue characterization we showed alterations at local extracellular matrix (ECM) level, (tissue-specific), which ultimately may lead to tissue loss and eventual rupture. The presence of various signs of cell death in tissues of patients with IH is particularly noteworthy, which could probably lead to progressive destruction of local fibroblasts. We achieved the second goal of characterizing primary fibroblasts in vitro, identifying an altered function in IH derived fibroblast (IHFs). We show that IHFs acquire a differential phenotype in vivo which is maintained in culture over different passages, affecting fundamental cellular processes. Finally, based on these evidences and to obtain a more complete picture of these events, knowing that local pathology can also cause changes in the mechanical tension of tissue, and using substrates with mechanical properties regulated, we have demonstrate that changes in substrate stiffness are sufficient to cause phenotypic and functional alterations in primary fibroblasts studied. The response differs between primary fibroblasts derived from patients with IH and fibroblasts derived from control patients. These results confirm that modulating substrate stiffness allows an in vitro approach to the study of certain aspects of fibroblast physiology in response to changes in rigidity of the connective tissue (i.e, present in HI).

In conclusion, our data provide indirect but convincing evidence that local ECM microenvironment can influence in the development of IH, acting in a specific manner for each tissue. These findings may be relevant by helping to identify new agents in the IH process, as would occurs in vivo, providing information to define new targets that could help different aspects of pathology: a) better identification and stratification of patients, b) improvement of clinical outcomes, c) contribute to adapt the design of the biomaterials to improve clinical performance.