Caracterització, quantificació i persistència en plantació del fong ectomicorrízic comestible Lactarius deliciosus en sistemes de producció controlada

Abstract

El projecte de tesi doctoral s'emmarca en la producció de plantes inoculades amb soques seleccionades del fong ectomicorrízic comestible Lactarius deliciosus i en el seguiment de la seva persistència un cop establert en camp. S'ha avaluat la capacitat colonitzadora de 25 soques de L. deliciosus en síntesi en cultiu pur amb Pinus pinaster. Els resultats han mostrat que les soques provades presenten diferent potencial colonitzador. La capacitat de formació de micorrizes s'ha relacionat de manera negativa amb el temps des de l'aïllament del cultiu i, de manera positiva, amb la capacitat de formació de rizomorfs. S'han posat a punt diferents tècniques moleculars per a la caracterització específica i intraespecífica de L. deliciosus i s'ha comprovat la seva efectivitat en la identificació en camp del fong en les fases críptiques de la simbiosi (micorriza i miceli extraradical present en el sòl). L'encebador LDITS2R, dissenyat a la regió ITS del rDNA de L. deliciosus, en combinació amb l'encebador universal ITS1 ha permès l'amplificació específica d'aquest fong mitjançant PCR a partir de DNA extret directament de mostres de camp. L'anàlisi single strain conformation polymorphisms (SSCP) dels productes específics amplificats ha permès distingir fins a nou patrons diferents entre les 18 soques de L. deliciosus analitzades que permeten la identificació intraespecífica de la soca seleccionada introduïda en camp. S'ha produït planta micorrizada amb L. deliciosus en hivernacle i s'ha posat a punt un sistema de quantificació individualitzada i no destructiva de la colonització radical inicial mitjançant l'anàlisi de fotografies digitals. La planta produïda s'ha establert en plantacions experimentals i s'ha avaluat la persistència del fong inoculat a diferents temps per recompte del percentatge de micorrizes i quantificació del miceli extraradical mitjançant PCR en temps real. S'ha conclòs que la persistència de les micorrizes i l'extensió del miceli en el sòl es veuen afectades per les condicions de la localitat d'establiment de la plantació i per la soca inoculada. En canvi, el nivell inicial de colonització no ha tingut un efecte significatiu, en les condicions assajades, en la persistència de L. deliciosus. Per últim, s'ha avaluat la persistència de L. deliciosus enfront a dues espècies de Rhizopogon potencialment competidores que poden desplaçar el fong introduït. S'ha detectat un efecte negatiu de R. roseolus en la persistència de L. deliciosus. Els resultats suggereixen que la competència entre aquests dos fongs té lloc a nivell del sistema radical per la colonització de les arrels lliures mentre que no s'ha detectat interacció negativa a nivell de miceli extraradical. La correlació entre el percentatge de micorrizes i la quantitat de miceli present en el sòl ha estat positiva per a les tres espècies estudiades. En conseqüència, la quantificació de miceli extraradical pot ser un bon indicador del grau de colonització radical de la planta i permetre un seguiment no destructiu del fong en camp.

The main objective of the thesis project is the production of inoculated plants with selected strains of the edible ectomycorrhizal fungus Lactarius deliciosus and tracking its persistence once established in field plantations. The colonization ability of 25 strains of L. deliciosus has been evaluated in pure culture synthesis with Pinus pinaster. The results have shown differences in root colonization level of the evaluated strains. The formation of mycorrhizas has been negatively related to the age of the fungal culture and positively to the formation of rhizomorphs. Different molecular techniques have been optimized for specific and intraspecific characterization of L. deliciosus and evaluated for their effectivity in field identification of the fungus in the cryptic phases of the symbiosis (mycorrhizas and extraradical mycelium present in the soil). The design of the primer named LDITS2R in the ITS region of the rDNA of L. deliciosus combined with the universal primer ITS1 has allowed specific amplification of this fungus by PCR from DNA extracted from field samples. Single strain confromation polymorphisms (SSCP) analysis of the specific amplified products has provided nine different patterns among the 18 L. deliciosus analyzed strains which allowed for the intraspecific identification of the selected inoculated strain. Plants mycorrhizal with L. deliciosus have been produced in the nursery and initial radical colonization has been individually quantified in a non-destuctive way by analysis of digital photographs. Experimental plantations have been established with the inoculated plants. Fungal persistence has been evaluated at different times by determining the percentage of mycorrhizas and the production of extraradical soil mycelium by real time PCR. The site and the inoculated strain significantly affected the persistence of mycorrhizas and the extension of the extraradical soil mycelium whereas no effect of the initial colonization level was observed under the experimental conditions tested. Finally, the persistence of L. deliciosus against two Rhizopogon species identified as potential competitors has been evaluated. The presence of R. roseolus in the field site affected negatively the persistence of L. deliciosus. The results obtained suggest that competition between these two fungi takes place at the root system level for colonization of the available roots. No negative interaction between extraradical mycelia of both species was observed. Linear correlations between the percentage of mycorrhizas and soil mycelium biomass were significant and positive for the three fungal species studied. Consequently, the quantification of extraradical mycelium could be a good indicator of the root colonization level of the plant allowing for non-destructive tracking of the fungus in the field.