Generación de una adenovirus Ad5/52s pseudotipado con la proteína fiber corta del Ad52 para su caracterización in vitro e in vivo como vector de terapia génica

Abstract

La terapia génica consiste en la manipulación y utilización de material genético para el tratamiento de patologías. No obstante, esta estrategia requiere el uso de vectores de terapia génica para transportar el material genético al tejido diana de forma eficiente. Los vectores de terapia génica más comunes son los basados en el adenovirus humano de serotipo 5 (Ad5), porque, respecto a otros serotipos, el Ad5 tiene como ventaja su bioseguridad y facilidad de producción. Sin embargo, para que una célula sea transducida por el Ad5 ha de expresar un receptor reconocible por el Ad5, principalmente la proteína CAR, al que se une a través de su proteína fiber. El fiber de otros serotipos de adenovirus se une a receptores diferentes, permitiendo así la transducción de tipos celulares alternativos a los transducidos por el Ad5. De esta manera, una de las estrategias utilizadas para obtener un vector Ad5 con el tropismo de un serotipo diferente, es la pseudotipación del adenovirus, que consiste en substituir el fiber del Ad5 por el de otro serotipo. De entre los serotipos de adenovirus humanos, uno de los más recientemente descritos es el Ad52. Este serotipo contiene dos fiber de diferentes longitudes, lo cual es un rasgo compartido con los adenovirus humanos intestinales de la especie F. Como el Ad52 fue identificado a partir de muestras de heces de pacientes con gastroenteritis, se le atribuye también un tropismo intestinal, aunque no se ha podido demostrar. En el caso de los adenovirus de la especie F, su fiber largo reconoce el receptor CAR y, por lo tanto, se asume que su tropismo intestinal es mediado por el fiber corto. Dada la cercanía evolutiva entre el Ad52 y los adenovirus de la especie F, se asume que su fiber largo también reconocerá el receptor CAR, mientras que el fiber corto lo hará a otro receptor, dándole así al virus un tropismo independiente de CAR. Así pues, en esta tesis se ha generado un vector quimérico Ad5 pseudotipado con el fiber corto del Ad52 (Ad5/52s) con la finalidad de estudiar el rol específico de esta proteína fiber y, a la vez, caracterizar este adenovirus como vector de terapia génica. La primera parte de la tesis consiste en la generación del genoma del adenovirus Ad5/52s y la producción del vector, lo que incluye un estudio de su ciclo viral para optimizar la producción. El resultado del ciclo viral indica que éste se encuentra moderadamente retrasado respecto al del Ad5. Una vez producidos los vectores, se comparó su tropismo con el del Ad5 en cultivos in vitro, demostrando que la substitución del fiber comporta un cambio en el tropismo del Ad5 hacia líneas celulares, así como también aumenta su transducción en células de Schwann primarias, aunque no aumenta el tropismo del Ad5 en modelos intestinales in vitro. Ya caracterizado el virus in vitro, se demostró que el fiber corto del Ad52 no tiene afinidad por el receptor CAR, y su unión al receptor es dependiente del dominio knob del fiber. Posteriormente, el estudio comparativo de su distribución in vivo por administración intravenosa respecto al Ad5, mostró que el Ad5/52s tan solo transduce ligeramente pulmón a pesar de no ser secuestrado en hígado. Una vez descartados problemas de estabilidad, se observó que la baja eficiencia de infección del Ad5/52s se debe a una mayor inactivación de este virus en sangre, probablemente por la interacción con algún factor plasmático como la trombina. Finalmente, se modificó el fiber corto para limitar esta interacción, lo que permitió aumentar la supervivencia del Ad5/52s en sangre.

Gene therapy is a biomedical approach, which consists of manipulating and delivering genes to treat a wide range of diseases. Nevertheless, a successful treatment also requires a vector to carry the therapeutic gene towards the targeted tissue and thus to increase itstransduction efficiency. Human adenovirus 5 derived vectors (Ad5) are the most commonly usedin gene therapy strategies due totheir higher biosafety and productivity. However, the Ad5 mediated transduction is restricted to those cells expressing appropriate viral receptors (mainly the CAR protein), recognized by the fiber protein. The fiber of other adenovirus serotypes binds to different receptors, allowing transduction of alternative cell types of those transduced by Ad5. Thus, one strategy to modify the natural Ad5 tropism is adenovirus pseudotyping, which consists of Ad5 fiber replacement by the fiber protein of another serotype. Among the different human adenovirus serotypes, one of the most recently described is Ad52. This serotype contains two fiber of different lengths, which is a common trait shared with enteric Ad40 and Ad41 human adenovirus. The Ad52 was initially found in stool samples obtained from patients with gastroenteritis and, as a consequence, it is supposed to be also an enteric virus, although it has not been demonstrated yet. In the specie F adenoviruses the long fiber recognizes the CAR receptor, and therefore, their enteric tropism is assumed to be mediated by the short fiber. Given the evolutionary relationship between the Ad52 and the species F adenoviruses, it is assumed that its long fiber also recognizes the CAR receptor, while the short fiber will recognize a different receptor, thus giving the virus a CAR-independent tropism. So, in this thesis we have generated a chimeric Ad5 vector pseudotyped with the Ad52 short fiber (Ad5/52s) protein, in order to study the specific role of the fiber protein, in turn, characterize this adenovirus as a vector for gene therapy. The first part of the thesis consists in the generation of adenovirus Ad5/52s genome and its production, which includes a study of its viral cycle to optimize production. The results show that the Ad5/52s viral cycle is moderately delayed compared to Ad5. Once the vectors were produced, the tropism of Ad5/52s and Ad5 were compared in in vitro, demonstrating that fiber replacement induces a switch in the Ad5 tropism in different cell lines, as well as an increased transduction in primary Schwann cells, but not in intestinal models in vitro. Then, it was also demonstrated that short fiber from Ad52 doesn’t recognizes the CAR receptor, and also that its binding is mediated by the fiber knob domain. Further studies to compare Ad5 versus Ad5/52 in vivo biodistribution after intravenous administration showed only a slight transduction in lung with Ad5/52s, despite not being trapped in liver. Once discarded stability problems, it was observed that the low levels of transduction achieved by the Ad5/52s were caused by a faster inactivation in plasma, probably by an interaction with a plasmatic factor, such as thrombin. Finally, to minimize this interaction, the short fiber was mutated, which enhanced the Ad5/52s survival in blood.