Caracterització i anàlisi del potencial terapèutic de l’Adenovirus 5/40 quimèric de tropisme específic intestinal com a vector de teràpia gènica per al tractament de la malaltia inflamatòria intestinal

Abstract

La Malaltia Inflamatòria Intestinal (IBD) engloba un grup de malalties (com la CD i la UC) que es caracteritzen per una inflamació crònica del tub digestiu. La IBD requereix un tractament mèdic i farmacològic a mida, i tot i que actualment existeixen diferents teràpies que permeten millorar la qualitat de vida dels pacients, cap d’aquestes aconsegueix eliminar totalment la malaltia. La teràpia gènica és una de les disciplines de la biomedicina amb més futur pel tractament de malalties d’origen genètic, però també en malalties en que la patologia no està determinada per un sol gen sinó que hi ha una alteració de la homeòstasis del sistema, com en càncer, malalties cardiovasculars o malalties neurològiques. Per tant la teràpia gènica sembla una alternativa prometedora per administrar localment a l’intestí una teràpia per a la IBD. Dintre de la família dels adenovirus, els vectors més utilitzats en teràpia gènica, hi ha el subgrup F (Ad40 i Ad41) amb tropisme intestinal. Aquests adenovirus es caracteritzen per la presència de dos fibers de diferent mida i pel seu pobre creixement in vitro. Mitjançant el pseudotipatge, es pot substituir els gens que codifiquen la proteïna fiber de l’Ad5, un dels vectors més utilitzats en teràpia gènica, per gens que codifiquen per la proteïna fiber curta de l’Ad40. D’aquesta manera, a més de canviar el tropisme natural de l’Ad5 pel tropisme del nou fiber, es millora la seva producció i es facilita la clonació de gens terapèutics. Així doncs, ens vam proposar caracteritzar i analitzar el potencial terapèutic d’adenovirus quimèrics 5/40 de tropisme específic intestinal per a la futura aplicació com vectors de teràpia gènica per a la Malaltia Inflamatòria Intestinal. En la primera part d’aquest treball ens vam centrar en caracteritzar els vectors quimèrics per tal de determinar les possibilitats reals per convertir-se en vectors de teràpia gènica. En primer lloc es va optimitzar el protocol de producció dels vectors, augmentant l’eficiència de 2-4 a 20 i 25 vegades per cada cicle, i es va estudiar quines noves característiques conferia el fiber curt de l’Ad40 a les partícules de l’Ad5. En la segona part es va avaluar la capacitat dels vectors quimèrics com a vectors de teràpia gènica a l’intestí. Es va comprovar que la presència del fiber augmentava la resistència a pH àcid dels vectors (tot i que no a proteases) i es va estudiar la biodistribució i bioseguretat d’aquests vectors en ratolins per tres vies diferents: oral, rectal i intravenosa mitjançant la quantificació de l’expressió de β-gal per luminometria i l’anàlisi histològic i immunohistoquímic de la transfecció adenoviral. Els resultats van mostrar que els adenovirus quimèrics administrats per la via rectal eren més eficients que l’Ad5, transfectant cèl·lules epitelials en vellositats i criptes intestinals, cèl·lules enteroendocrines i macròfags locals de la mucosa intestinal. Un cop avaluada la capacitat dels adenovirus quimèrics d’infectar l’intestí de ratolins sans, es va procedir a avaluar si mantenia la seva infectivitat en un model murí de MMI, escollint el model de colitis induïda per DSS. En la tercera part d’aquest treball es van generar nous vectors quimèrics que permetessin la clonació fàcil i ràpida de qualsevol gen terapèutic. En resum, en aquest treball demostrem que amb el pseudotipatge del fiber curt de l’Ad40 es transfereixen moltes de les característiques singulars dels Adenovirus entèrics, i es proposa un protocol optimitzat per a la seva producció a nivells equivalents als de l’Ad5. Els nostres resultats també suggereixen que l’adenovirus quimèric F/40S es un excel·lent candidat com a vector estratègia de teràpia gènica per a l’administració de gens terapèutics a l’intestí de manera local.

Inflammatory Bowel Disease (IBD) comprises a group of diseases (such as CD and UC) characterized by a chronic inflammation of the digestive tract. The IBD requires a personalized medical and pharmacological approach, and although currently there are different therapies to improve the quality of life of patients, none of these has healed the disease. Gene therapy is one of the most promising biomedical disciplines for the treatment of genetic diseases, but also for other diseases in which the pathology is not determined by a single gene, but there is an alteration of the homeostasis of the system, such as cancer, cardiovascular disease and neurological diseases. Therefore, gene therapy seems a promising alternative to administer local therapy in the intestine for IBD. Within the family of adenovirus vectors, the most used vectors in gene therapy, there is subgroup F adenovirus (Ad40 and Ad41) with intestinal tropism. These adenoviruses are characterized by the presence of two different size fibers and its poor growth in vitro. By pseudotyping technique, you can replace the genes encoding the Ad5 fiber protein, one of the most used adenoviral vector, for the genes encoding the protein of Ad40 short fiber. Thus, besides changing the natural tropism of Ad5 tropism by the new fiber, it improves production and simplify the cloning of therapeutic genes. Therefore, we decided to analyse and characterize the therapeutic potential of chimeric adenovirus 5/40 specific intestinal tropism for future use as gene therapy vectors for Inflammatory Bowel Disease. In the first part of this work, we focused on characterizing the chimeric vector to determine the real possibilities to become gene therapy vectors. Firstly, we optimize the protocol for the vectors production, increasing the efficiency from 2-4 times to 20 and 25 times per cycle, and we studied what new features the Ad40 short fiber transferred to Ad5 particles. In the second part, we evaluate the ability of chimeric vectors as gene therapy vectors in the intestine. We found that the presence of fiber increased vectors resistance to acidic pH (but not to proteases) and we studied the biodistribution and biosafety of these vectors in mice by three different routes: oral, rectal and intravenous by quantifying the expression of β-gal luminometry and by histology and immunohistochemistry analysis of adenoviral transfection. The results showed that the chimeric adenovirus administered by rectal route were more efficient than Ad5, transfecting intestinal epithelial cells in villi and crypts, and enteroendocrine cells and local macrophages in intestinal mucosa. After evaluating the ability of chimeric adenovirus to infect the intestines of healthy mice, we proceeded to assess their infectivity capacity in a MMI animal model of MMI, choosing the model of DSS-induced colitis mice. In the third part of this work, we generate new chimeric vectors that allow easy and fast cloning of any therapeutic gene. In summary, this work shows that the short fiber of the Ad40 pseudotipying transferred many of the unique characteristics of enteric adenovirus, and it proposes an optimized protocol for production levels equivalent to the Ad5. Our results also suggest that the chimeric adenovirus F/40S is an excellent candidate as a gene therapy vector for for the local administration of therapeutic genes in the gut