Neuroprotective gene therapy strategies applied to the acutely damaged immature rat brain

Abstract

Un daño agudo al sistema nervioso central (SNC) desencadena una serie de eventos complejos e interrelacionados, entre los cuales encontramos tres especialmente importantes: excitotoxicidad, estrés oxidativo e inflamación. En particular, el cerebro inmaduro muestra varias características que lo hacen especial en cuanto a sus reacciones frente a lesioned agudas. En este contexto, la presente Tesis contribuye al conocimiento básico de los procesos de estrés oxidativo e inflamación que ocurren luego de una lesión excitotoxica mediada por inyección de NMDA en el cerebro inmaduro. Asimismo, desarrolla estrategias neuroprotectoras mediante la utilización de nuevos vectores de terapia génica combinados con la sobreexpresión de enzimas antioxidantes. <br/>Esta Tesis muestra que la expresión de una de las enzimas antioxidantes más importantes, la Cu/Zn superoxide dismutase (SOD), en el cerebro inmaduro normal se observa principalmente en neuronas, pero también en la glia limitans y la pared de los ventrículos cerebrales. Sin embrago, 4 horas después de una lesión excitotóxica, la enzima muestra una importante reducción en las neuronas afectadas por la lesión aguda inicial, ocurriendo esto antes de que estas neuronas iniciaran un proceso de muerte neuronal. A partir del primer día postlesión la expresión de SOD comienza a aumentar en astrocitos reactivos. La nitrotirosina, un producto del peroxinitrito, en el cerebro inmaduro luego de la lesión mostró un incremento en neuronas del núcleo de la lesión, y al día 1 postlesión también se observó en astocitos. Es interesante destacar que los astrocitos nitrados a partir de los 3 días postlesión delimitaban una subpoblación celular mostrando como características principales un alto grado de hipertrófia, elevados niveles de GFAP, expresión de novo de vimentina y SOD, y expresando metalotiooneina I/II, siendo siempre los astrocitos más reactivos. Asimismo, a pesar de encontrarse altamente nitrados y expresar la caspasa 3 activa en su núcleo, estos astrocitos no mostraron ningun signo morfológico de muerte celular ni tinción para TUNEL, lo cual sugiere que estas células no mueren al menos hasta los 7 días postlesión. <br/>Esta Tesis se centró seguidamente en el desarrollo de nuevas estrategias de terapia génica basadas en vectores proteicos modulares recombinantes. Cuando estos vectores fueron inyectados intracerebralmente 4 horas luego de la lesión, fueron capaces de transfectar células en toda la zona lesionada del cerebro inmaduro. Asimismo, fueron capaces de transfectar tanto neuronas como astrocitos y microglía, sin generar inflamación adicional. Con estos resultados prometedores, una de estos vectores se utilizó para sobreexpresar la SOD 2 horas luego de la lesión. Esta sobreexpresión indujo una disminución en los niveles de nitrotirosina, una disminución en el volúmen de lesión, un aumento en la supervivencia neuronal, y una recuperación funcional significativa cuando se compararon con animales lesionados e inyectados con solución salina control. Sorprendentemente, esta Tesis muestra que estos vectores poseen un potencial neuroprotector endógeno, que es mediado por sus dominios de interacción con integrinas Arg-Gly-Asp (RGD), ya que la inyección in vivo de un pequeño péptido ciclico con la secuencia RGD también resultó neuroprotector a niveles similares. En cultivos celulares mixtos de corteza cerebral, tanto los vectores como el péptido RGD fueron protectores frente a un daño inducido por NMDA, pero no lo fueron en cultivos purificados de neuronas corticales, sugiriendo que el efecto neuroprotector es dependiente de células gliales.<br/>Esta Tesis concluye que el estrés oxidativo, y en particular la vía del superóxido/peroxinitrito, contribuyen de manera fundamental al desarrollo de una lesión aguda en el cerebro inmaduro. Asimismo, la sobreepresión de SOD puede ser una interesante estrategia neuroprotectora. Finalmente, concluye que los vectores proteicos recombinantes modulares pueden actuar eficientemente in vivo luego de una lesión aguda al cerebro inmaduro, produciendo niveles terapéuticos de proteinas neuroprotectoras.

Acute central nervous system (CNS) damage consists of a multitude of inter-related and complex events, playing excitotoxicity, oxidative stress and inflammation important roles in the initial and secondary injury. In particular, the immature brain displays several characteristics that make it special in its reactions against acute injuries. In this context, this Thesis contributes to the basic understanding of the oxidative stress and inflammation occurring after an NMDA-mediated excitotoxic lesion to the immature brain, and to the development of neuroprotective gene therapy strategies for reducing immature brain damage by inhibiting oxidative stress. <br/>This Thesis shows the in vivo expression and cell localization of one of the most important antioxidant proteins, Cu/Zn superoxide dismutase (SOD), whose expression was observed mainly in neuronal cells, glia limitans and ependyma in the normal immature brain. However, after an excitotoxic lesion, the expression of this enzyme rapidly disappeared (at 4 hours) from the acutely affected neurons before they underwent cell death. One day after, expression of SOD begun to increase in reactive astrocytes, present in the lesion for up to 7 days, the last time studied. Moreover, in the normal brain, the peroxynitrite product nitrotyrosine was observed in neurons and scattered astrocytes, however, after the excitotoxic lesion it was early increased in neurons of the lesion core, and after at 1 day post-lesion it increased also in astrocytes. Interestingly, the nitrated hypertrophied astrocytes from 3 days post-lesion onward represented a separated population of cells sharing several markers such as vimentin, metallothionein, SOD, and high GFAP content and hypertrophy, being always phenotypically the most reactive astrocytes. In addition, although being heavily nitrated and showing activated caspase 3 in their nuclei, nitrated astrocytes did not display any morphological sign of cell death nor TUNEL staining at any time-point studied. <br/>The next step of this Thesis was to explore the putative beneficial effects of the overexpression of SOD after the NMDA excitotoxic lesion. This Thesis focused on the development of a new gene therapy strategy based on a non-viral modular recombinant protein vector. These vectors could deliver a transgene to the whole excitotoxically lesioned zone of the immature brain when injected 4 hours after the lesion. Moreover, they could transfect neurons, astrocytes and microglial cells, without generating additional inflammation. With these promising results, one of these protein vectors was used for overexpressing SOD 2 hours after the excitotoxic lesion. SOD overexpressing animals displayed decreased nitrotyrosine formation, reduced lesion volume, increased neuronal survival, and a complete functional recovery after 3 days in relation to NMDA+saline injected animals. Surprisingly control lesioned animals injected with the protein vector overexpressing the transgene for the green fluorescent protein or with the naked protein vector without any DNA, showed also a reduced lesion volume. Finally this Thesis showed that the neuroprotective potential of the protein vectors was mediated by the vectors integrin-interacting Arg-Gly-Asp (RGD) motif, as a cyclic RGD peptide was sufficient to induce this neuroprotection. Accordingly, both the protein vector and the cyclic RGD peptide were neuroprotective against a NMDA mediated injury to mixed cortical cultures. However, none of these molecules were neuroprotective under the same treatment conditions in cortical neuron purified cultures, suggesting that the neuroprotective mechanisms include triggering of a glial derived neurotrophic phenotype. <br/>This Thesis concludes that oxidative stress, and in particular the O2-./ONOO- pathway is a mayor contributor to lesion expansion in the acutely injured immature brain, and that the overexpression of SOD is an interesting neuroprotective strategy. In addition, it shows that modular recombinant protein vectors are efficient gene therapy vectors that can be applied to therapeutic interventions to the acutely lesioned immature brain.