ADAMTS1 i TFPI-2: Estudi de la seva interacció funcional i les implicacions en la plasticitat tumoral

Abstract

Històricament, la ECM (matriu extra cel·lular) ha estat considerada com un lloc inanimat amb una funció per a les cèl·lules purament estructural. Més endavant, diversos experiments varen revelar que és un escenari dinàmic amb importants implicacions en processos fisiològics i patològics, entre ells el desenvolupament embrionari i la progressió tumoral, respectivament. Junt amb altres components, les proteases tenen un paper essencial en aquestes activitats i són dianes importants en el desenvolupament de noves teràpies. Una de les fites en l'estudi de les proteases és el descobriment de parells/substrats específics. Durant aquesta tasca es poden dur a terme diverses tècniques, que cobreixen des de les aproximacions bioquímiques a les animals. ADAMTS1 (A Disintegrin And Metalloprotease with ThromboSpondin motifs - 1) representa un membre de la família ADAMTS de proteases extra cel·lulars. En aquest treball descrivim la seva interacció amb el Tissue Factor Pathway Inhibitor-2 (TFPI-2), un inhibidor putatiu de serín proteases. Aquesta molècula té un paper important en el control homeostàtic de l'activitat proteolítica en la ECM, i està també implicada en el fenomen del VM (mimetisme vasculogènic). A més, aquesta interacció implica el tall de l'inhibidor en la regió C-terminal de l'inhibidor produït per ADAMTS1. Aquesta regió està carregada positivament i està implicada amb la interacció amb components de la ECM carregats negativament, com són els proteoglicans heparan sulfatats. Així, el tall promou una deslocalització de l'inhibidor en el compartiment extra cel·lular. Aquest resultat va ser confirmat en sistemes cel·lulars i xenografts. Com hem mencionat abans, el TFPI-2 està implicat en el VM. Aquest fenotip tumoral implica que les cèl·lules tumorals formen pseudo-xarxes vasculars riques en components de la ECM que poden transportar plasma i eritròcits. Aquest fenotip representa un mecanisme novedós de vascularització tumoral independent de l'angiogenesis per ramificació. La presència de ADAMTS1 i del TFPI-2 va ser confirmada en models cel·lulars VM+ que inclouen cèl·lules de sarcoma de Ewing i de melanoma. A més, es va poder demostrar en aquests models el tall C-terminal del TFPI-2. La confirmació de la importància d'ambdues molècules va ser demostrada en un model de fibrosarcoma que manca de la seva expressió basal i que no presenta VM, però que aquest és clarament induït en un assaig de xenograft d'una manera dependent d'ADAMTS1. Es va estudiar l'expressió de vàries molècules implicades en el VM, i en concordància amb altres models es va observar la seva sobre expressió, com és el cas de la cadherina específica d'endoteli, implicada en les interaccions homotípiques entre cèl·lules endotelials. Malgrat que les cèl·lules parentals de fibrosarcoma manquen de l'expressió de la VE-cadherin aquesta molècula es troba sobre expressada en els xenografts que expressen ADAMTS1. Un estudi més detallat mostra que les cèl·lules de fibrosarcoma comparteixen un perfil genètic molt similar al de les cèl·lules endotelials. El VM és considerat un paradigma de la plasticitat tumoral. Per aquesta raó també es va examinar l'expressió del marcador de cèl·lula mare CD-133. Entre diferents cèl·lules tumorals les cèl·lules parentals de fibrosarcoma mostren l'expressió més elevada del CD-133, però interesantment els xenografts que tenen un fenotip positiu per VM disminueixen la seva expressió. Hipotetitzam que la disminució de la capacitat "stem" dels xenograts positius per VM és deguda a una disminució en la plasticitat, motivada per la diferenció cap a un fenotip més endotelial. En conseqüència d'aquest treball, es veu necessari un estudi en profunditat dels mecanismes implicats en el VM, ja que representen un mecanisme alternatiu a l'angiogènesi tumoral amb conseqüències importants en la generació de resistència a la teràpia antiangiogènica.

Historically the extracellular matrix (ECM) has been perceived as an inanimate place with a mere cell structural function. Later on, multiple experiments unravelled that it is a dynamic scenario with important implications in physiological and pathological processes, such as embryonic development and tumor progression, respectively. Along with other constituents, proteases have a prominent role in the remodelling of the ECM and they represent an important target for the development of new therapies. A main goal in the study of proteases is the discovery of specific partners/substrates. Several techniques can be pursued to discern those specific substrates, including biochemical to animal approaches. ADAMTS1 (A Disintegrin And Metalloprotease with ThromboSpondin motifs - 1) represents a member of the ADAMTS family of extracellular proteases. In this work we describe its interaction with Tissue Factor Pathway Inhibitor-2 (TFPI-2), a putative serine protease inhibitor. TFPI-2 has a prominent role in the homeostatic control of proteolytical activity in the ECM, and is also implicated in the vasculogenic mimicry (VM) phenomenon. Moreover, this interaction implicates a direct cleavage event in the C-terminal fragment of the inhibitor by ADAMTS1, region positively charged and relevant for the anchorage of TFPI-2 to negatively charged ECM components such as heparan sulfate proteoglycans. Thus, the cleavage event promotes a delocalization of the inhibitor from the ECM compartment. This result was confirmed in cellular and tumor systems. As mentioned, TFPI-2 was found to be involved in VM. This phenotype implicates that tumor cells produce pseudo-vascular networks rich in ECM components, only lined by tumor cells and capable to transport plasma and erythrocytes. This phenotype represents a new mechanism of tumor vascularization independent of sprouting angiogenesis. The presence of both ADAMTS1 and TFPI-2 was confirmed in VM+ cell models, including Ewing sarcoma and melanoma cells. Indeed, the C-terminal cleavage event of TFPI-2 was demonstrated in these models. We further confirmed the importance of these molecules in a fibrosarcoma cell model that did not undergo VM when they are absent, at basal conditions, but it was clearly induced in xenograft assays in an ADAMTS1-dependent manner. We studied the expression of several molecules implicated in VM and, accordingly to other models, we observed its up-regulation, as the endothelial-specific VE-Cadherin implicated in homotypic interaction between endothelial cells. Although parental fibrosarcoma cells lack VE-cadherin expression, this molecule appears overexpressed in xenografts that harbour ADAMTS1. A more detailed analysis showed that these fibrosarcoma cells share a gene signature similar to endothelial cells. VM is being studied as a paradigm of tumor plasticity. For that reason we also examined the expression of the stemness marker CD-133. Parental fibrosarcoma cells showed the highest expression among various tumor cells, but intriguingly, xenografts showing a VM positive phenotype presented a reduced CD133 expression. We hypothesized that the decrease in the stemness capacity showed by VM positive xenografts is linked to the diminution in plasticity when cells starts an endothelial commitment. According to these results, a more detailed study of the mechanism that underlies VM is needed, as it represents an alternative to tumoral angiogenesis, with important consequences in the generation of resistance to antiangiogenic therapy.