Estudi citogenètic del primer corpuscle polar d'oòcits d'hàmster i d'humans: diagnòstic genètic preimplantacional mitjançant l'anàlisi de primer corpuscle polar

Abstract

El primer corpúsculo polar (1CP) es una célula que acompaña al ovocito maduro (MII) y se produce como consecuencia de la primera división meiótica en la gametogénesis femenina. Ambas células tienen dotaciones cromosómicas complementarias y por ese motivo el 1CP puede informar indirectamente de la dotación cromosómica del correspondiente ovocito, sin que este pierda su capacidad reproductiva. Este hecho permite que en el marco de un programa de fecundación in vitro (FIV) se puedan biopsiar los 1CP y diagnosticar indirectamente los ovocitos, evitando la transferencia de embriones procedentes de ovocitos afectos de la anomalía genética o cromosómica estudiada. Este procedimiento se conoce con el nombre de diagnóstico genético preimplantacional mediante análisis de 1CP (DGP-1CP) y permite detectar alteraciones genéticas o anomalías cromosómicas de origen materno, en concreto de primera división meiótica.<br/>El objetivo general de este trabajo ha sido poner a punto un método de DGP-1CP mediante la técnica de análisis citogenético molecular conocida con el nombre de hibridación in situ fluorescente (FISH). Nos hemos centrado en la aplicación clínica del DGP-1CP en mujeres portadoras de translocaciones robertsonianas y mujeres portadoras de translocaciones recíprocas.<br/>La metodología de obtención de extensiones cromosómicas de 1CP para realizar el análisis citogenético, se ha puesto a punto en un modelo animal (hámster, Mesocricetus auratus) y se ha adecuado a ovocitos humanos descartados de ciclos de FIV antes o después de su inseminación. Los Comités Éticos de la Universidad Autónoma de Barcelona (UAB) y del Centro de FIV correspondiente han aprobado el protocolo a seguir para realizar el presente estudio y los ovocitos han sido donados por pacientes cuando estaban llevando a cabo su ciclo de FIV.<br/>Se han elaborado dos series de parejas 1CP-MII procedentes de ovocitos humanos no inseminados y descartados post inseminación, y se ha demostrado que las dotaciones cromosómicas son complementarias. La tasa de aneuploidia ha sido nula para ovocitos no inseminados y de un 5,1 % en ovocitos descartados por no mostrar signos de fecundación. La concordancia en parejas 1CP-MII en ovocitos no inseminados ha sido del 100 % y del 95,1 % en ovocitos descartados post inseminación. <br/>También se han estudiado citogeneticamente, ovocitos inmaduros y cigotos humanos anómalos, descartados de ciclos de FIV después de su inseminación y donados por las pacientes. Tras el análisis citogenético mediante FISH, se ha demostrado que un 25,4 % de los complementos cromosómicos correspondientes a ovocitos inmaduros son euploides en estadio de metafase I y el resto son aneuploides. Se ha observado una mayor incidencia de aneuploidia en ovocitos inmaduros descartados post inseminación (88,2 %) que en ovocitos inmaduros no inseminados (47,1 %). En cuanto a los cigotos anómalos descartados de ciclos de FIV con inseminación convencional por tener más de dos pronúcleos, en todos ellos la ploidía correspondía al número de núcleos observado. Por el contrario los cigotos con un único pronúcleo pueden ser diploides (88,9 %) o haploides (11,1 %).<br/>Aplicando el DGP-1CP a cinco mujeres portadoras de translocaciones robertsonianas y a cuatro mujeres portadoras de translocaciones recíprocas, y haciendo una revisión de los casos publicados hasta el momento, se ha hecho evidente que en mujeres portadoras de translocaciones robertsonianas la frecuencia de ovocitos cromosómicamente normales o equilibrados para la anomalía estudiada es del 60 % y en mujeres portadoras de translocaciones recíprocas es del 40 %. Se ha evidenciado una correlación estadísticamente positiva entre la frecuencia teórica de puntos calientes de recombinación y la incidencia observada de no disyunción de cromosomas homólogos en mujeres portadoras de translocaciones recíprocas con mínimo nuevo ovocitos diagnosticados.

In females, the particular characteristics of the gametogenesis allow the indirect characterization of the chromosome constitution of the gamete through the study of the first polar body (1PB) and these presents an opportunity for germ line analysis. The 1PB contents a chromosome set complementary to that of the oocyte. Thus, the 1PB can be analysed to obtain information on the chromosomal constitution of the corresponding oocyte, which is maintained in culture.<br/>Preimplantation genetic diagnosis (PGD) using the first polar body is a modality of PGD that can be used when the woman is the carrier of a genetic disease or of a balanced chromosomal reorganization.<br/>Here, we describe a procedure to obtain 1PB chromosome complements and our experience based on the analysis by fluorescent in situ hybridization (FISH) of unfertilized or fresh human oocytes and non-inseminated control human oocytes, by fixing separately the 1PB and the corresponding oocyte, and on the study of nine clinical cases of PGD using 1PB biopsy (five Robertsonian translocations and four reciprocal translocations).<br/>The method was developed in an animal model (Syrian hamster). Human samples were donated by patients undergoing in-vitro fertilization (IVF) cycles. The Informed Consent Form and the protocol for the study were approved by the Ethics Committees of the Universitat Autònoma de Barcelona (UAB) and the IVF Centre.<br/>In fresh oocytes, the chromosome morphology of the 1PB was well preserved, and the results were always concordant for each 1PB-oocyte pair. This indicates that the 1PB can be reliably used for the diagnosis of chromosome reorganizations. The frequency of aneuploidy was zero in fresh oocytes and 5.1 % in unfertilized oocytes.<br/>Moreover, we describe the study of immature oocytes and abnormal zygotes from IVF cycles. We observed that 25.4 % of the chromosome complements from immature oocytes, were euploid in metaphase I, and the rest of complements were aneuploid. We observed more aneuploidy in immature oocytes discarded post insemination (88.2 %) than in immature oocytes non-inseminated (47.1 %). The ploidy of all zygotes with more than two pronuclei was concordant with the number of nuclei observed. Nevertheless, the zygotes with only one pronucleus were 88.9 % diploids and 11.1 % haploids.<br/>Applying PGD-1PB to five female carriers of Robertsonian translocations and four carriers of reciprocal translocations, and reviewing the cases published, we observed that in women carriers of Robertsonian translocations robertsonianas and in women carriers of reciprocal translocations, the frequency of normal or balanced oocytes was 60 %, and 40 % respectively. In reciprocal translocation cases, published in the literature or studied by us, in whom at least nine oocytes had been diagnosed, a correlation has been found between the frequency of non-disjunction observed and the theoretical recombination rate.