A transcriptomic approach toward understanding PAMP-driven macrophage activation and dietary immunostimulation in fish

Abstract

Los peces son claramente el grupo más exitoso y diverso de vertebrados, representando el 40% de todas las especies de vertebrados y mostrando un impresionante nivel de diversidad en distintos aspectos biológicos. Exhiben un gran número de particularidades genómicas únicas entre los vertebrados, que presentan a los peces como un modelo muy interesante para diversas disciplinas, en particular aquellas relacionas con la evolución. Por estas razones, algunas especies de peces han tenido un papel muy importante en los últimos años en el incremento del conocimiento de la especialización del genoma en vertebrados. Por otra parte, tienen una importancia vital como comida, siendo la acuicultura un sector productor alimentario esencial en todo el mundo. El objetivo del presente trabajo ha sido caracterizar ciertos aspectos moleculares y funcionales del sistema inmune de dos especies distantes en la evolución, Sparus aurata (dorada) y Oncorhynchus mykiss (trucha arco iris), con especial énfasis en sus respuestas transcriptómicas a diferentes estímulos relativos a patógenos. Con esta finalidad, análisis in vivo e in vitro fueron combinados para evaluar mecanismos inmunitarios globales de estos teleósteos. <br/>Los Macrófagos representan un grupo importante de células que poseen un papel principal en la iniciación y coordinación de la respuesta inmune. Se desarrolló y caracterizó un cultivo primario de macrófagos diferenciados in vitro de dorada, investigando aspectos como morfología, capacidad fagocítica y respuesta a lipopolisacárido (LPS) de este tipo celular. En paralelo, CD83, una proteína de membrana utilizada como marcador estándar de células dendríticas en mamíferos fue clonada y analizada usando Q-PCR (PCR a tiempo real, cuantitativa). A continuación, los macrófagos diferenciados de dorada fueron comparados con los de trucha, evaluando sus diferencias en la activación de vías antivirales bajo la inducción de LPS y las implicaciones de la presencia de contaminantes en preparaciones comerciales de LPS. La expresión de varios genes antivirales fue cuantificada mediante Q-PCR. Para analizar más profundamente las respuestas inmunes de macrófagos, su regulación transcriptómica en respuesta a LPS bacteriano y Poly (I:C) viral fue estudiada utilizando una plataforma de microarray de cDNA enriquecida en genes con funciones inmunes, resultados que fueron posteriormente validados con Q-PCR, junto con el análisis mediante western blot de la liberación de la citoquina inflamatoria Factor de Necrosis Tumoral &#945; (TNF&#945;). Finalmente, la regulación de cortisol y la respuesta trancriptómica de los teleósteos a una modulación inmune fue evaluada a través de la administración de dietas inmunoestimulantes, que son comúnmente utilizadas en acuicultura. A través de diversos análisis, utilizando la plataforma de microarray, hibridaciones in situ y cuantificación de los niveles de cortisol en plasma por R.I.A., estudiamos respuestas específicas en tejidos (riñón anterior, bazo, intestino y branquias) en truchas alimentadas durante cuatro semanas con una dieta inmunoestimulante, en condicones basales y siguiendo una inducción con LPS. Los resultados obtenidos han sido presentados y discutidos en este trabajo.

Fish are by far the most successful and diverse group of vertebrates, representing 40% of all vertebrate species and displaying an amazing level of diversity in several biological aspects. They exhibit a number of genomic particularities unique among vertebrates that present fish as a very interesting model to gain an insight into a wide variety of disciplines, in particular those related to evolution. Therefore some fish species have played important roles in the latest years to increase the knowledge of vertebrate genome speciation. On the other hand, they are of tremendous importance as food for people, becoming the aquaculture industry an essential food-producing sector all around the world. The goal of the present study has been to characterize several molecular and functional aspects of the immune system of two evolutionary distant fish species, Sparus aurata (gilthead sea bream) and Oncorhynchus mykiss (rainbow trout), with specific emphasis on their transcriptomic responses to different pathogen-related challenges. To that end, in vivo and in vitro analyses were combined to evaluate global immune mechanisms of these teleosts.<br/>The macrophage cell lineage represents an important group of cells which play a central role in the initiation and coordination of the immune response. A primary culture of in vitro differentiated macrophages of gilthead sea bream was developed and characterized; therefore aspects as morphology, phagocytic capacity and response to lipopolysaccharides (LPS) of these cells were investigated. In parallel, CD83, a cell surface membrane used as standard surface marker for dendritic cells in mammals, was cloned and then analyzed from the gilthead sea bream macrophages using Q-PCR (real-time quantitative-PCR). Once this in vitro model was characterized and validated, differentiated macrophages of gilthead sea bream were compared with those of rainbow trout to evaluate their differences in the activation of antiviral-related pathways upon LPS induction and the implications of the presence of contaminants in commercial LPS preparations when analyzing regulation of gene expression. Expression of antiviral genes in macrophages stimulated with different LPS preparations were quantified with Q-PCR. To further address rainbow trout macrophages immune responses, their transcriptomic regulation in response to bacterial LPS and viral Poly I:C was studied using a salmonid-specific cDNA microarray platform enriched in immune-related genes and validated with Q-PCR, together with the analysis of the release of the pro-inflammatory cytokine tumor necrosis factor &#945; (TNF&#945;) by western blot. Finally, the cortisol regulation and transcriptomic response of teleost fish to immuno-modulation were investigated via the administration of immunostimulant diets, which are commonly utilized in aquaculture. Using the salmonid-specific microarray platform, in situ hybridizations and quantification of plasma cortisol levels by radioimmunoassay, we studied tissue specific (head kidney, spleen, intestine and gills) responses in rainbow trout fed for four weeks with a commercial immunostimulant diet, in a basal situation and following a challenge with LPS. The results obtained are presented and discussed in this report.