Anàlisi completa d'aneuploïdies d'origen femení i de malalties monogèniques en embrions: el diagnòstic genètic preimplantacional de doble factor (DF-PGD)

Abstract

El Diagnòstic Genètic Preimplantacional (o DGP) és un conjunt de metodologies, que s'apliquen en el transcurs d'un cicle de reproducció assistida, i que permeten la selecció d'embrions sans en parelles afectes de malalties genètiques hereditàries com la fibrosi quística o l'hemofília, entre moltes altres.<br/>A més, també s'utilitza per realitzar un cribatge d'alteracions cromosòmiques (o aneuploïdies) que puguin afectar l'embrió, ja que s'ha evidenciat que aquestes són molt abundants en avortaments. S'ha postulat que una selecció positiva dels embrions lliures de aneuploïdies (és a dir, euploides) hauria d'augmentar la taxa d'embaràs dels embrions transferits al pacient. Publicacions recents, però, han demostrat que encara que es seleccionin els embrions euploides, la taxa d'embaràs no millora significativament, essent al voltant del 13%, mentre que en pacients als quals no s'aplica el DGP és del 30%. <br/>Un dels motius per aquest reduït èxit bé pot ser la tècnica utilitzada per realitzar el cribatge de aneuploïdies, la FISH, que limita l'estudi a només nou dels 23 cromosomes de l'embrió, quedant doncs més de la meitat sense diagnosticar. Per tant, els embrions que es transfereixen com euploides utilitzant la FISH poden contenir aneuploïdies per a qualsevol dels cromosomes restants no analitzats, fet que implica que l'embrió no implanti o que no generi un embaràs viable. <br/>Alternativament a la FISH, existeix la CGH que permet la detecció de tots els 23 cromosomes de l'embrió. La CGH s'ha aplicat prèviament en el DGP, però té l'inconvenient del temps necessari per realitzar la metodologia, que és de tres dies i que implica que no hi ha prou temps per diagnosticar els embrions abans de transferir-los a la pacient. Així doncs, els embrions s'han de congelar a l'espera d'obtenir els resultats de la CGH, per a ser transferits els que siguin euploides en un altre cicle de reproducció assistida. Aquest procés té apart de la desavantatge de les molèsties que implica la necessitat d'aplicar dos cicles de reproducció assistida contigus a la pacient, el fet que entre el 20-40% dels embrions no sobreviuen al procés de congelació / descongelació. Això pot suposar que encara que un embrió hagi estat diagnosticat com euploide per a tots els cromosomes mitjançant CGH, no es pugui arribar a transferir degut a no sobreviure a la congelació / descongelació. <br/>Per tal de solucionar aquestes desavantatges, una proposta metodològica alternativa és analitzar indirectament el ovòcit mitjançant estudi del corresponent 1er corpuscle polar (1CP). Amb aquesta alternativa, consistent en biopsiar el 1CP a després de la fecundació (o Dia 0), es disposa de fins a 4 dies per obtenir el resultat de la CGH. Això possibilita poder transferir en el mateix cicle de reproducció assistida els embrions derivats d'oòcits potencialment euploides, sense necessitat de congelar i descongelar. Aquesta proposta té el desavantatge, de quedar fora d'anàlisi les anomalies cromosòmiques d'origen masculí o les produïdes en el propi embrió durant les primeres divisions. Malgrat aquesta limitació, i atès que el 80% de les aneuploïdies l'embrió s'originen en l'ovòcit, l'anàlisi amb CGH de l'ovòcit permet detectar la majoria d'embrions aneuploides. Per això aquesta aproximació metodològica és molt adequada per al DGP. <br/>En aquesta tesi doctoral, s'ha aplicat un protocol de DGP per evitar malalties genètiques conjuntament amb un cribatge de aneuploïdies d'origen femení mitjançant la CGH aplicada al 1CP. Aquest doble diagnòstic genètic s'ha definit com diagnòstic genètic preimplantacional de doble factor (o DF-PGD) i ha estat aplicat, durant aquesta tesi doctoral per primera vegada en tot el món. <br/>Concretament, el DF-PGD s'ha aplicat a embrions de deu famílies afectes de Fibrosi Quística, la Síndrome d'Angelman o bé de Von Hippel-Lindau, aconseguint incrementar la taxa d'embaràs fins al 33%, respecte del 12,5% que és la que s'obté quan no es realitza aquest doble anàlisi. S'ha produït el naixement de quatre nadons sans per les respectives malalties familiars. Tot i admetent que aquests resultats són preliminars, apunten que el procediment del DF-PGD és útil per diagnosticar les malalties genètiques hereditàries i a la vegada, permet un augment considerable de la taxa d'embaràs en aquest grup de pacients. <br/>Amb l'objectiu de constatar si el DF-PGD indicat no només a dones d'edat avançada, sinó també en dones joves, aquesta tesi inclou un estudi citogenètic complet d'ovòcits de dones joves, analitzant mitjançant la CGH ambdues cèl·lules constituent del ovòcit madur: el 1CP i la corresponent MII. S'han inclòs en l'estudi dels 84 oòcits de dones joves (de 24 a 26 anys) que participen en programes de donació d'ovòcits en centres de reproducció assistida. S'ha evidenciat que un 40% dels ovòcits contenen aneuploïdies. Així doncs, el DF-PGD pot ser una bona opció per millorar l'actual taxa d'embaràs en pacients amb malalties genètiques hereditàries, independentment de l'edat de la pacient. <br/>En conclusió, en aquesta tesi doctoral s'ha evidenciat que el DF-PGD és una variant de DGP que no només és molt recomanada per a parelles en les quals la dona té una edat reproductiva avançada (més de 35 anys) sinó també per a parelles joves, i que pot resultar molt útil per incrementar les actuals taxa d'embaràs.

Preimplantation genetic diagnosis (or PGD) is a set of methodologies that is applied during a cycle of assisted reproduction, allowing the selection of healthy embryos in couples suffering from inherited genetic diseases as cystic fibrosis, haemophilia and many others. <br/>It also is used to perform a screening for chromosomal abnormalities (or aneuploidy) that may affect the embryo, as it has become clear that these are very abundant in abortions. It has been postulated that a positive selection of embryos free of aneuploidy (i.e. euploid embryos) should increase the pregnancy rate of embryos transferred to the patient. Recent publications, however, have shown that although the selection of euploid embryos, the pregnancy rate does not improve significantly, with about 13%, whereas patients who did not apply the DGP are 30%. <br/>One reason for this limited success may well be the technique used for screening for aneuploidy, the FISH, which limits the study to only nine of the 23 chromosomes of the embryo, thus leaving more than half undiagnosed. Therefore, the embryos are transferred as euploid using FISH may contain aneuploidy of the other chromosomes not analyzed, which implies that either a failure of the embryo implantation.<br/>Alternatively to the FISH, the CGH technique allows the detection of all 23 chromosomes of the embryo. The CGH has been applied previously in the PGD, but has the disadvantage of the time required for the methodology, which is three days and that means that there is not enough time to diagnose embryos before transferring them to the patient. Thus, embryos must be frozen to await the results of the CGH to be transferred. This process has the disadvantage of being apart from the discomfort that implies the need to implement two cycles of assisted reproduction to the patient, the fact that between 20-40% of embryos do not survive the process of freezing / thawing. This may mean that while an embryo has been diagnosed as euploide for all chromosomes by CGH, can not be transferred due to not surviving the freezing / thawing process.<br/>To overcome these disadvantages, an alternative methodology is to analyze indirectly through study of the corresponding oocyte corpuscle 1st Polar (1PB). With this alternative, consisting of the biopsy in 1PB after fertilization (or Day 0), it is up to 4 days for the result of the CGH. This enables transfer in the same cycle of assisted reproduction embryos derived from oocytes euploides potentially without the need to freeze and thaw. This proposal has the disadvantage of being left out of the analysis of chromosomal abnormalities or male origins were produced in the embryo during the first division. Despite this limitation, given that 80% of embryo aneuploidy originates in the oocyte, the CGH analysis of oocytes can detect the majority of aneuploid embryos. Therefore the methodological approach is very suitable for the DGP. <br/>In this thesis, we have implemented a protocol for PGD to avoid disease with a genetic screening for aneuploidy in female origin by CGH applied to 1PB. This dual genetic diagnosis has been defined as preimplantation genetic diagnosis of double-factor (or DF-PGD) and has been applied during this thesis for the first time around the world. <br/>Specifically, the DF-PGD has been applied to embryos of ten families affected by cystic fibrosis, Angelman syndrome or von Hippel-Lindau, achieving pregnancy rate increased to 33% on the 12.5% which is obtained when the DF-PGD is not analysis. There was the birth of four healthy babies by their illness relatives. Even accepting that these results are preliminary, it suggests that the proceedings of the DF-PGD is useful for diagnosing hereditary genetic diseases and also allows an increase in pregnancy rate in this group of patients. <br/>Aiming to establish whether the DF-PGD indicated not only older women but also young women, this thesis includes a comprehensive cytogenetic study of oocytes from young women looking through CGH both constituent cells of mature oocyte, the 1CP and the corresponding MII. We performed a study of young women 84 oocytes (24 to 26 years) involved in egg donation programs in assisted reproduction centres. After its analysis, we concluded that 40% of the oocytes contain aneuploidy. Thus, the DF-PGD may be a good option to improve the current pregnancy rate in patients with inherited genetic diseases, regardless of the age of the patient.<br/>In conclusion, this thesis has shown that the DF-PGD is a variant of PGD is not only highly recommended for couples where the woman has an advanced age (over 35 years) but also for young couples and that can be useful to increase the current rate of pregnancy.