Estudio del efecto neuroprotector de tratamientos farmacológicos en un modelo in vitro de lesión excitotóxica de médula espinal de rata basado en cultivos organotípicos

Abstract

En la presente tesis doctoral se ha establecido y caracterizado un modelo in vitro de lesión excitotóxica por glutamato basado en cultivos organotípicos de médula espinal de rata postnatal de 7-8 días. La optimización del medio de cultivo sin suero permite mantener los explantes más de 15 días in vitro con unas características en cuanto a la citoarquitectura y al número de motoneuronas similares a las obtenidas con medio con suero. Sobre los explantes se han establecido dos modelos de lesión; una mecánica y otra excitotóxica. Para establecer la lesión excitotóxica se han utilizado diferentes concentraciones de glutamato que provocan una respuesta dependiente de dosis. Esta respuesta se ha evaluado cuantificando la cantidad de homodímero-1 de etidio, un marcador fluorescente que es captado por las células dañadas, mediante el análisis de imágenes y cuantificando el número de motoneuronas supervivientes. Asimismo, se ha caracterizado que esta lesión está mediada principalmente por el receptor de glutamato NMDA. Las motoneuronas en desarrollo postnatal sufren un cambio en las subunidades NR2A y NR3B el cual se mimetiza en los explantes organotípicos en nuestras condiciones de cultivo. Una vez estandarizado el modelo de lesión excitotóxica se ha utilizado para evaluar el efecto neuroprotector de diversos fármacos como son la eritropoyetina, el riluzol, el rolipram, el valproato, la región c terminal de la toxina tetánica y la metilprednisolona (ver Trabajo I). Este modelo ha sido de utilidad asimismo para analizar los mecanismos moleculares de algunos de estos fármacos como el FK506 y el ligando PRE084 del receptor sigma 1. El análisis ha permitido establecer que el FK506 preserva el parénquima tisular frente a la lesión, efecto que es favorecido por la modulación de los niveles de la chaperona Hsp70 que el FK506 produce sobre la microglia (ver Trabajo II). Por último, se ha podido observar que el PRE084 ejerce un efecto neuroprotector e inductor de la elongación neurítica en las motoneuronas del explante, y que dichos efectos son mediados por la PKC aunque no por la activación de CREB (ver Trabajo III).

We have established and characterized an in vitro model of excitotoxic injury by glutamate based on organotypic cultures of spinal cord from postnatal rats of 7-8 days. The optimized culture medium without serum allows the culture of the explants over 15 days in vitro. The cultures maintain a cytoarchitecture and a motoneuron number similar to those observed with the serum-containing medium. On the explants we have established a mechanical injury model and an excytotoxic model. On the excytotoxic injury we have used different glutamate concentrations with a doses-dependent response that was evaluated by the image analysis of the EthD (Ethidium homodimer-1) uptake, and the quantification of the number of surviving motoneurons. We observed that this lesion is mainly mediated by the NMDA receptor. The spinal cord explants underwent a NR2A and NR3B subunit change similar to that observed on the rat postnatal development. The established in vitro injury model of excitotoxic lesion has been used to assess the neuroprotector effect of different drugs like erithropoyetin, riluzole, rolipram, valproate, the tetanus toxin c-terminus, and methilprednisolone (see section I). This model has been useful to analyze the molecular mechanisms of FK506 and the ligand of the sigma receptor 1, PRE084. We observed that FK506 protects the tissular parenchyma against the glutamate excitotoxic injury thanks to the modulation of Hsp70 levels induced by FK506 on the microglia (see section II). We observed that PRE084 has a neuroprotector effect and that it is an inductor of the neurite elongation on the explant motoneurons. The aforementioned effects are mediated by the PKC, although not by the activation of CREB (see section III).