Biosistemes analítics integrats per a aplicacions industrials i mediambientals

Abstract

En el marc d’aquesta tesi s’han desenvolupat tres biosistemes analítics integrats que mostren: 1) la millora substancial que suposa realitzar un procés d’integració, encara que aquest sigui parcial, en el rendiment analític de les metodologies proposades; 2) com la miniaturització, en diferents graus, permet augmentar de forma significativa la robustesa, la sensibilitat o la selectivitat dels sistemes proposats; i 3) noves solucions a la problemàtica comuna dels biosensors i biosistemes analítics consistent en la pèrdua d’activitat de l’element biològic. El primer treball descriu la construcció d’un biosensor amperomètric per a glucosa basat en un biocompòsit de grafit i resina epoxi. L’enzim glucosa oxidasa (GOD) i la sal orgànica conductora tetratiafulvalé-tetracianoquinodimetà (TTF·TCNQ) s’incorporen al compòsit per formar un biosensor renovable. S’avaluen diferents proporcions grafit/TTF·TCNQ/GOD per tal d’optimitzar el sensor pel que fa a les seves prestacions analítiques i posteriorment integrar-lo en un sistema d’anàlisi per injecció en flux (FIA), amb una cel·la dissenyada especialment a tal efecte. Els millor resultats en la determinació de glucosa en begudes refrescants s’obtenen amb una composició de 5% de GOD, 76% de polímer, 9.5% de grafit i 9.5% de TTF·TCNQ. El segon treball descriu el disseny, construcció i avaluació d’un analitzador miniaturitzat basat en la tecnologia de ceràmiques verdes (Low temperature co-fired ceramics, LTCC) per a la determinació de pesticides, que integra una etapa de pretractament mitjançant dos mescladors tridimensionals i un sistema de detecció amperomètrica per mesurar el producte de una reacció d’inhibició enzimàtica. El sistema de detecció s’integra de forma monolítica a la plataforma de fluídica, i consisteix en dos làmines de platí com a elèctrodes de treball i auxiliar, i d’un elèctrode de referència serigrafiat. El sistema és caracteritzat i avaluat satisfactòriament per la determinació de carbofuran a nivell nanomolar. Per últim, es descriu un mètode ultrasensible per determinar toxicitat deguda a pesticides en un lab-on-a-chip de vidre mitjançant la inhibició de l’enzim acetilcolinesterasa immobilitzat sobre partícules magnètiques. S’optimitzen la introducció de forma reproduïble d’una quantitat controlada de partícules modificades amb l’enzim al canal del xip i la seva captura en una zona determinada mitjançant l’ús d’un camp magnètic extern. Aquest procediment permet de forma fàcil i altament reproduïble la renovació del material biosensor després de cada determinació. S’avaluen o optimitzen el potencial de treball per a la detecció selectiva de tiocolina en un elèctrode platí, la reproductibilitat i sensibilitat en la detecció de tiocolina, el voltatge del flux electroosmòtic i el temps de la reacció d’inhibició. S’aconsegueix la determinació del pesticida carbofuran (un dels pesticides carbamats més tòxics) a nivell nanomolar.

Three integrated analytical biosystems have been developed within the scope of this thesis, showing: 1) the substantial improvement in the analytical performance of the proposed methodologies thanks to the Integration process; 2) how miniaturisation provides significant increases of the robustness, sensitivity and selectivity of the proposed systems; and 3) new solutions to the loss of activity of the biological element of biosensors and analytical biosystems. The first work describes how an amperometric glucose biosensor based on graphite and non-conducting epoxy resin biocomposite was constructed. Glucose oxidase (GOD) and the tetrathiafulvalene-tetracyanoquinodimethane (TTF•TCNQ) conducting organic salt were incorporated into the bulk of the composite to form a renewable biosensor. Several graphite-TTF•TCNQ ratios (w/w) were studied in order to select the best biosensor to be integrated in a FIA system for the automated detection of glucose. The optimal amount of GOD in the composite was studied as well. The selection was based on the analytical response of the electrodes. Best results were obtained by an electrode whose composition was 5% GOD, 76% polymer, 9.5% graphite and 9.5% TTF•TCNQ. An especially designed flow amperometric cell was constructed so that the biosensor could be integrated into a FIA system and glucose in beverage samples could be determined. In the second work the design, construction and evaluation of a miniaturized analyser for pesticides determination that integrates a pre-treatment stage, based on two three-dimensional mixers or reactors, and an amperometric detection system to measure the product of an enzymatic inhibition reaction are presented. The detection system was monolithically integrated in the microfluidic platform and it consisted of a screen-printed reference electrode and two platinum sheets, acting as auxiliary and working electrodes, which were embedded within the ceramic structure. The miniaturized system was characterized and successfully evaluated by determining carbofuran at nanomolar level. Finally, in the third work an ultrasensitive method to determine toxicity due to pesticides in a glass lab-on-a-chip by means of enzymatic inhibition of acetylcholinesterase immobilised on magnetic beads is described. The reproducible insertion of a controlled amount of enzyme-coupled magnetic beads inside the chip channel and their immobilisation in a capture region with the aid of a magnetic field has been optimised. This procedure enables the easy renewal of the biosensing material after each determination in a highly reproducible manner. Several operational parameters such as the working potential for the selective detection of thiocholine (TCh) on a platinum disc electrode, the TCh detection reproducibility and sensitivity, the electroosmotic flow driving voltage and the inhibition time were also evaluated or optimised. The detection of carbofuran (one of the most toxic carbamate pesticides) has been achieved down to the nanomolar level.