A step forward in recombinant protein production regulated by the constitutive GAP promoter in Pichia pastoris through bioprocess engineering approaches

Abstract

La producció de proteïnes recombinants, tant per aplicacions terapèutiques com industrials, dóna lloc a un mercat que anualment genera milers de milions de dòlars. Entre els organismes hostes destacats que solen ser emprats per a la seva producció, actualment el llevat Pichia pastoris és una de les plataformes d’expressió més efectives i versàtils. Des d’un punt de vista operacional i industrial, i com a alternativa als àmpliament estesos processos basats la utilització de metanol, l’ús del promotor constitutiu GAP ofereix avantatges molt importants. Malgrat aquestes avantatges, però, el desenvolupament d’estratègies de cultiu que doni lloc a processos de producció eficients regulats pel promotor GAP està considerat, encara avui en dia, en un estadi molt primerenc.

Al llarg del curs d’aquesta tesi, diversos paràmetres claus per a assolir millores en termes de rendiment i productivitat en els processos de producció de proteïnes recombinants amb l’esmentat sistema d’expressió van ser abordats a través de les eines de l’enginyeria de bioprocessos. El desenvolupament i implementació de noves estratègies de cultiu va ser dut a terme per a una soca de P. pastoris que expressa constitutivament el fragment d’unió a antigen (Fab) humà 2F5 com a proteïna model. No obstant, s’espera que les millores en els processos de producció assolits siguin també aplicables a l’expressió d’altres proteïnes recombinants d’interès.

Inicialment, amb l’objectiu de valorar l’efecte causat per la capacitat de secreció limitada àmpliament estudiada en aquest hoste d’expressió, un protocol de disrupció cel·lular i d’extracció de proteïnes va ser desenvolupat i optimitzat. Aquests mètodes van permetre assolir un increment molt important en la precisió, i per tant en la veracitat, de la quantificació de producte retingut intracel·lularment.

L’ús de glucosa i de glicerol com a fonts de carboni va ser comparat per les dues fases del cultiu en fed-batch. La selecció de diferents substrats per a cadascuna de les fases va donar lloc a efecte positius importants en el cultiu. Addicionalment, l’efecte de la taxa específica de creixement a la taxa de específica producció va ser estudiat mostrant una clara relació entre la formació de producte i el creixement de biomassa com a resultat d’un important efecte transcripcional de la taxa específica de creixement en el metabolisme central del carboni, i a la vegada, en l’expressió de la proteïna d’interès. Per contra, no va poder ser observat un efecte evident de la taxa específica de creixement a la capacitat de secreció del llevat. Per tant, es van dur a terme cultius en fed-batch a una taxa de creixement alta i constant assolint taxes de producció significativament més elevades respecte d’altres cultiu basats en altres estratègies d’alimentació de font de carboni.

L’impacte de condicions ambientals d’estrès a la fisiologia cel·lular de l’hoste va ser caracteritzat i estudiat amb l’objectiu de millorar significativament els rendiments i les taxes de producció de la proteïna recombinant. Concretament es van obtenir increments importants de producció implementant tant condicions limitants d’oxigen com de deprivació de font de carboni en cultius de P. pastoris. De nou, s’hipotitza que aquests increments estan causats per la regulació del metabolisme central del carboni induïda per la resposta adaptativa de l’hoste a les noves condicions ambientals.

Globalment, el resultat d’aquest estudi és una temptativa amb èxit d’aplicar el coneixement de la fisiologia de l’hoste d’expressió en el disseny racional d’estratègies de cultiu amb l’objectiu de maximitzar el rendiment i la productivitat de processos de producció de proteïnes recombinants explotant paràmetres claus del sistema que augmenten l’expressió de la proteïna.

Recombinant protein, including biopharmaceuticals proteins and industrial enzymes, is a multi-billion dollar market. Among all the suitable host organisms commonly used for its production, the yeast Pichia pastoris is currently one of the most effective and versatile expression platform. From an operational and industrial point of view, alternatively to the widely extended methanol-based processes, the use of the constitutive GAP promoter offers very important advantages. However, the development of cultivation strategies for efficient production processes regulated by the constitutive GAP promoter can be considered that still remains in its infancy.

In the course of this thesis various crucial factors towards increasing the yield and productivity of the process for the production of recombinant proteins with the mentioned expression system were addressed through bioprocess engineering approaches. The development and implementation of the new cultivations strategies was performed for a P. pastoris strain expressing constitutively the human 2F5 antigen-binding fragment (Fab) as a model protein. Nevertheless, it is expected that the production process developments achieved are also applicable for the expression of other recombinant proteins of interest.

Initially, in order to evaluate the effect caused by the reported limiting secretory capacity of the host cell system, a cell disruption and a protein extraction procedure were developed and optimized. These methods allowed achieving an important increase in the accuracy, and therefore reliability, of intracellular product quantification.s

The use of glucose and glycerol as a carbon sources was compared for both phases of a fed-batch cultivation. Important positive effects were observed selecting different substrate for each phase. Furthermore, the effect of the specific growth rate on the specific production rate was studied showing a plain correlation between product formation and biomass growth as a result of the strong transcriptional effect of the specific growth rate in the central carbon metabolism, and in turn, protein of interest expression. In contrast, no clear effect of the specific growth rate could be observed in the secretory capacity of the yeast. Accordingly, fed-batch cultivation at constant and high specific growth rates were carried out reaching production rates significantly higher than cultures based on others carbon source feeding strategies.

The impact of environmental stress conditions on the host cell physiology has been characterized and used in order to enhance significantly the yields and production rates of the recombinant protein. Important production increases have been achieved by carrying out P. pastoris cultivations implementing either carbon-starving or oxygen-limiting conditions. Once more, the increments were hypothesised to be caused by the regulation of the central carbon metabolism induced by the host adaptation response to the new environment.

Overall, the outcome of this study is a successful attempt to apply the host cell system physiology understanding on the rational design of cultivation strategies towards maximizing the yields and productivity of recombinant protein production processes by the exploitation of key factors that enhances the protein expression.